人肺腺癌細(xì)胞耐順鉑機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究背景： 肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，WHO的資料顯示，肺癌將成為21世紀(jì)對人類威脅最大的腫瘤。肺癌的治療是一種多學(xué)科的綜合治療，其中化療為治療的重要手段之一。但目前對晚期NSCLC病人化療的有效率僅為30-40％，其五年生存率小于15％。肺癌的耐藥性是造成化療失敗的重要原因。研究腫瘤細(xì)胞的耐藥產(chǎn)生機(jī)制已成為國內(nèi)外科學(xué)工作者的重要課題。系統(tǒng)地研究腫瘤耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，往往是多因素參與、多種機(jī)制同時存在的事件，而且不同機(jī)制間常相

2、互影響。目前發(fā)現(xiàn)p170糖蛋白質(zhì)、多藥耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)、肺耐藥蛋白質(zhì)、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶等多藥耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)與腫瘤多藥耐藥性相關(guān)。發(fā)現(xiàn)的與耐藥有關(guān)的機(jī)制可歸納為以下幾個方面：細(xì)胞膜或胞漿與胞核之間藥物攝入和外流的改變使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低；在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器水平的藥物亞細(xì)胞分布的改變，使藥物無法接近其作用靶點(diǎn)；細(xì)胞內(nèi)藥物靶酶水平改變或細(xì)胞內(nèi)酶與藥物親和力改變而導(dǎo)致的耐藥；腫瘤細(xì)胞解毒功能和修復(fù)功能增強(qiáng)，促使藥

3、物代謝加強(qiáng)而導(dǎo)致的耐藥；細(xì)胞代謝的變化和腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)等。雖然已有的研究揭示了一些腫瘤的耐藥機(jī)制，但目前仍然不能完全解釋腫瘤耐藥現(xiàn)象并有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥。蛋白質(zhì)組學(xué)是動態(tài)研究一個細(xì)胞、組織或有機(jī)體中所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的新興學(xué)科，利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究的高通量特點(diǎn)，有可能發(fā)現(xiàn)新的耐藥相關(guān)蛋白，為解釋耐藥機(jī)制和有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥提供線索。為此，本研究以人肺腺癌細(xì)胞株A549和耐順鉑細(xì)胞株A549/CDDP為研究對象，采用蛋白質(zhì)組學(xué)

4、的技術(shù)和方法研究肺癌耐藥的分子機(jī)制。 第一章人肺腺癌A549及A549/CDDP細(xì)胞株蛋白質(zhì)組學(xué)分析 目的：建立A549及A549/CDDP細(xì)胞株總蛋白的雙向凝膠電泳圖譜(2-DE)，分析辨別兩組間的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)。方法：1.常規(guī)培養(yǎng)A549及A549/CDDP細(xì)胞，用四氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測A549/CDDP細(xì)胞耐藥指數(shù)(RI)。2.采用一步抽提法制備A549及A549/CDDP細(xì)胞株的總蛋白質(zhì)，應(yīng)用雙向凝膠電泳

5、技術(shù)建立凝膠電泳圖譜，膠體考馬斯亮藍(lán)染色，Image Scanner掃描儀掃描凝膠。3.PDQuest軟件對兩株細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果：1.A549/CDDP對順鉑的耐藥指數(shù)為7.8。 2.獲得了分辨率高和重復(fù)性好的A549、A549/CDDP細(xì)胞總蛋白的2-DE圖譜，兩組間有15個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，在A549/CDDP組有8個表達(dá)上調(diào)，7個表達(dá)下調(diào)。結(jié)論1.人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/CDDP耐藥性較好。2.獲

6、得了分辨率高和重復(fù)性好的A549、A549/CDDP細(xì)胞總蛋白的2-DE圖譜。為下一步的實驗奠定了基礎(chǔ)。 第二章 A549、A549/CDDP細(xì)胞株差異蛋白的鑒定與驗證 目的：鑒定與驗證A549、A549/CDDP細(xì)胞株差異表達(dá)蛋白質(zhì)，尋找肺癌順鉑耐藥的相關(guān)蛋白質(zhì)。方法：采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，獲取MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，用Ma

7、scot軟件查詢NCBInr和SWISS-PROT、數(shù)據(jù)庫搜索鑒定差異蛋白。并應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)和R17-PCR驗證部分鑒定的蛋白質(zhì)。結(jié)果：初步鑒定了13個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，多數(shù)與腫瘤的生長、浸潤、代謝、免疫等相關(guān)。這些蛋白質(zhì)按功能主要可以分為五類，即代謝相關(guān)酶，細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)，分子伴侶，與解毒和DAN修復(fù)相關(guān)蛋白質(zhì)，以及信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)。免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR也顯示了丙酮酸激酶M2(Pyruvate kinase M2，PKM2

8、)、細(xì)胞角蛋白18(Cytoskeletal 18，CK18)在兩組間存在表達(dá)差異。結(jié)論：1.經(jīng)質(zhì)譜分析及生物信息學(xué)檢索在A549、A549/CDDP細(xì)胞株2-DE圖譜中表達(dá)差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，初步鑒定出13種蛋白質(zhì)，提示這些蛋白可能與肺腺癌細(xì)胞耐藥株耐藥相關(guān)。2.用細(xì)胞免疫化學(xué)和RT-PCR法對CK18，PKM2進(jìn)行進(jìn)一步驗證，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)一致，說明采用蛋白質(zhì)組學(xué)篩選出來的差異蛋白在A549、A549/CDDP中確實存在，可作為候選

9、的肺癌耐藥相關(guān)蛋白，并可進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)功能的研究。 第三章　SiRNA-PKM2封閉PKM2基因表達(dá)與肺癌順鉑耐藥的相關(guān)性研究 目的：應(yīng)用載體介導(dǎo)的RNAi干擾技術(shù)抑制PKM2在A549細(xì)胞株中的表達(dá)，分析PKM2與肺腺癌順鉑耐藥的關(guān)系，初步探討PKM2的功能。方法：培養(yǎng)A549細(xì)胞，設(shè)計SiRNA-PKM2，通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)。實驗分：對照組、空白載體組、SiRNA-neg組、SiRNA-PKM21組、Si

10、RNA-PKM22組。1.分別用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和RT-PCR方法檢測SiRNA-PKM2對A549細(xì)胞中PKM2表達(dá)的影響。2.用SiRNA-PKM2封閉A549細(xì)胞后，應(yīng)用四氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測其耐藥性的變化。結(jié)果：1.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：SiRNA-PKM21組、SiRNA-PKM22組PKM2的陽性系數(shù)與對照組比較，差異有顯著性(P＜0.05)，而對照組、空白載體組、SiRNA-neg組之問比較，無顯著性差異(P>0.0

11、5)，SiRNA-PKM21組和SiRNA-PKM22組之間比較有顯著性差異。RT-PCR方法檢測各組細(xì)胞PKM2mRNA的表達(dá)，SiRNA-PKM21組、SiRNA-PKM22組PKM2mRNA的相對表達(dá)強(qiáng)度依次為0.3350±0.0370，0.6750±0.0940與對照組、空白載體組、SiRNA-neg組比較，差異有顯著性(P＜0.05)，而對照組、空白載體組、SiRNA-neg組之間比較，無顯著性差異(P＞0.05)，SiRNA