豬2型鏈球菌免疫蛋白質組學與比較蛋白質組學的研究.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，S．suis）屬于球菌科、鏈球菌屬，是世界范圍內致豬鏈球菌病最主要的病原。該菌可分為35個血清型，其中豬2型鏈球菌(SS2)致病性強、流行廣，該型亦是臨床分離頻率最高的血清型。SS2可引起豬腦膜炎以及敗血癥等疫病，人通過特定的傳播途徑亦可感染該菌，是一種重要的人畜共患病病原。1991年黃毓茂首次報道在廣東省發(fā)現(xiàn)豬2型鏈球菌病疑似病例，1998-1999年江蘇省部分地區(qū)連續(xù)2年在盛夏季節(jié)暴發(fā)

2、該病，不但造成大量豬死亡，而且有數(shù)十人感染致死。2005年在四川資陽及周邊地區(qū)發(fā)生的豬2型鏈球菌病，引起204人感染發(fā)病，導致38人死亡。全球因豬2型鏈球菌感染已引起300多人死亡。盡管豬鏈球菌作為嚴重危害養(yǎng)殖業(yè)和危及人類健康的傳染病病原，但其致病機理和免疫機理研究卻相對滯后。雖然滅活疫苗可以對同型細菌提供保護力，但對其他血清型卻缺乏保護力。疫苗的抗原成分不清制約著新型疫苗的開發(fā)。因此我們使用免疫蛋白質組學的相關技術開展從SS2細胞壁相

3、關蛋白中鑒定免疫原性蛋白的研究，并進行了從SS2細胞壁免疫原性蛋白中篩選保護性抗原的研究，力圖為新型疫苗和診斷試劑的開發(fā)奠定基礎。與此同時，我們應用比較蛋白質組學對SS2感染前后宿主血清蛋白質的變化開展了研究，以期發(fā)現(xiàn)SS2感染的標志物和/或研究SS2的致病機理?，F(xiàn)將主要研究結果報告如下：
　　 1．SS2細胞壁相關蛋白的免疫蛋白質組學研究
　　 利用雙向電泳將提取的豬2型鏈球菌細胞壁相關蛋白進行分離，并同時使用滅活疫苗

4、免疫血清、人工感染康復期血清、臨床感染康復期血清以及陰性對照血清與2-D分離的細胞壁相關蛋白進行Western Blot，篩選免疫原性蛋白進行質譜分析鑒定。本研究共從細胞壁相關蛋白中鑒定了34個免疫原性蛋白，其中15個蛋白可以為所有的免疫血清和康復血清所識別，包括目前報道的疫苗候選抗原溶菌酶釋放蛋白(MRP)、表面蛋白1(SAO)和重要的粘附蛋白：3-磷酸甘油醛脫氫酶(GapdH)。其他相關研究所鑒定的免疫原性蛋白淀粉酶結合蛋白Bamy

5、lase-binding protein B(AbpB)，內皮素轉化酶l(Endothelin-convertingenzyme1)和核酸酶（putative5’-nucleotidase）也在本研究中成功篩選鑒定，說明本研究結果可靠。15個蛋白中有9個蛋白的免疫原性在本研究中首次被發(fā)現(xiàn)。另外，SecA、自溶酶（autolysin）、次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶(ImpdH)和高親和力的鋅攝取系統(tǒng)znuA前體蛋白(znuA)只為康復血清所識別

6、而不為免疫血清所識別，通過熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)相對于體外培養(yǎng)的細菌，感染豬腦部細菌的autolysin,ZnuA，ImpdH，和SecA的mRNA均出現(xiàn)了125士38，85±45，10士4和9387±1366倍的增長。表明這些基因在體內（至少在感染豬的腦部）誘導表達。本研究篩選鑒定的免疫原性蛋白無疑為闡明疫苗抗原成分具有重要意義，也為新型疫苗和診斷試劑的研究奠定了基礎。
　　 2．SS2新型保護性抗原的研究
　　 克

7、隆所篩選的29個豬2型鏈球菌細胞壁免疫原性蛋白，并重組表達純化。Western Blot驗證重組蛋白的免疫反應性。將純化的重組蛋白與弗氏佐劑乳化后制備疫苗分別免疫小鼠，使用低劑量(5LD50)和高劑量(20LD50)的SS2攻毒檢測重組蛋白的免疫保護效果。研究發(fā)現(xiàn)，在使用低劑量攻毒時大部分蛋白免疫的小鼠都可以保護，但使用高劑量攻毒時能提供較高保護力的只有HP0197、HP1036和Enolase。ELISA試驗證實這些蛋白均可以誘導高水

8、平的抗體，主要為Th2型免疫應答。Real-time PCR表明相對于體外培養(yǎng)的細菌，感染豬腦部細菌的mRNA均上調表達，并且鑒定的保護性抗原均可與Hep-2細胞的表面粘附，表明這些蛋白可能參與了細菌的致病過程。本研究成功從豬2型鏈球菌細胞壁免疫原性蛋白中篩選到保護性抗原，為新型疫苗的開發(fā)奠定了基礎。
　　 3．SS2感染后血清蛋白質組學的研究
　　 血漿/血清蛋白質由于其組成中包含了來源于細胞、組織、器官的蛋白信息，研

9、究疾病與健康狀態(tài)下血漿蛋白質的差異，將極大促進疾病的早期診斷與治療監(jiān)測等方面的進步，也有利于闡明疾病的發(fā)生機制，尋找有效的治療方法，發(fā)現(xiàn)有效疫苗及新的藥物靶標。本研究通過血清比較蛋白質組學的方法比較SS2感染前后血清中蛋白質的變化，發(fā)現(xiàn)了9個最具生物學意義的差異表達蛋白點，進行質譜分析，共鑒定了其中5個點（4個蛋白），分別為上調表達的α1-抗胰蛋白酶、血清珠蛋白、補體C4，以及下調表達的載脂蛋白AI。本研究提示了對這些血清蛋白的研究將促