蛋白質組分析條件的優(yōu)化與弱精癥患者精液比較蛋白質組學研究.pdf

1、目的:優(yōu)化基于MALDI-TOF-MS的蛋白質組分析條件，研究弱精癥患者與正常生殖能力者精液中精子和精漿蛋白質表達差異，探討弱精不育機制。 方法:在優(yōu)化蛋白質組分析條件時，選取對蛋白組研究結果有較大影響的MALDI-TOF-MS分析條件、數據準確度、搜索引擎采用、數據庫選擇以及主要參數設置進行考察，用BSA數據來建立標準參數模型，以CAH2_BOVIN、Hsp70s數據為訓練對象檢驗標準參數，最后獲得優(yōu)化的蛋白質分析條件。

2、 在弱精癥患者精液比較蛋白質組學研究中，收集臨床上確認的弱精癥精液樣本，分別制備精子和精漿；采用2-DE分離/銀染檢測差異表達蛋白策略進行圖譜分析，對差異表達蛋白以胰蛋白酶(trypsin)酶解，肽段混合物經MALDI-TOF-MS鑒定獲得PMF數據，MS-Fit數據庫搜索，最終獲得有關蛋白質的信息。 結果： 1、以BSA質譜數據為研究對象，考察了經MALDI-TOF-MS獲得PMF時分析條件及準確度對蛋白質數據庫搜索

3、結果的影響。 2、以CAH2_BOVIN質譜數據為訓練集建立模型，然后以人Hsp70s數據進行檢驗，優(yōu)化了PMF鑒定蛋白質的生物信息學分析條件。 3、以弱精患者精子/精漿為研究對象，在不同的條件下進行2-DE，獲得了較高分辨率的凝膠圖譜，同時分離得到的蛋白質點滿足了質譜分析的要求。 4、弱精患者組與正常組精子的比較蛋白質組學研究：與正常組比較，從弱精患者組精子樣本中發(fā)現高度表達而正常樣本中缺失或表達下調的27個蛋白點以及

4、在正常精子中存在而在弱精不育精子中缺失或低表達的37個點，經PMF鑒定和蛋白質數據庫搜索，初步找到了47相關蛋白質。 5、弱精患者組與正常組精漿的比較蛋白質組學研究：從正常組樣本中發(fā)現24個蛋白點高表達(3個在不育缺失)，18個蛋白點在不育高表達(3個蛋白點在正常缺失)，經肽質量指紋譜鑒定和蛋白質數據庫搜索獲得36個蛋白相關信息，并對EDH1、PSMA、KCL1和CDC25A等蛋白進行了Western blot確認。 結

5、論 MALDI-TOF-MS的離子化是一種由基質介導的、復雜的固相/氣相過程，分析條件的選擇對后續(xù)蛋白質搜索結果的影響十分明顯，合適的分析條件可以給實驗結果帶來高可信度。要獲得正確的PMF必須高度重視質譜分析條件的選擇與優(yōu)化。質譜分析參數的選擇包括質譜精確度的控制、激光強度的選擇、加速電壓的設定、延遲時間和激光擊打次數的選擇等。 與經典的蛋白質研究不同，在蛋白質組學的研究工作中，是通過質譜數據與蛋白質數據庫的比對來獲得鑒

6、定結果的，如果所獲得的質譜數據有誤差，或與蛋白質數據庫比對時的參數設置不合理，將對搜索結果產生很大的影響。本研究的結果表明，Swissprot最適合于做PMF搜索的數據庫；從搜索引擎來說，通過兩個引擎進行搜索是較為合理的，這樣可避免漏檢和降低候選蛋白的誤選幾率；對漏切位點、質量容錯數等參數的選擇應根據研究要求進行優(yōu)化。弱精患者的精子蛋白質組對應于蛋白質的轉錄、合成、轉換、轉運等環(huán)節(jié)，均出現了相關功能蛋白的上調或下調。精漿蛋白質組的差異表