血漿-血清-體液蛋白質(zhì)組學_第1頁
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文檔簡介

1、血漿、血清、體液蛋白質(zhì)組學研究及其應(yīng)用,1,,蛋白組學基本知識,2,血漿、血清蛋白組學,唾液蛋白組學,尿液蛋白組學,腦、脊液蛋白組學,一、蛋白組學基本知識,3,4,蛋白質(zhì)組(proteome = protein + genome):一種細胞、組織或生物體完整基因組所對應(yīng)的全套蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學(proteomics)研究細胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學,5,基本生物學問題Post-translational mo

2、dificationProtein-protein interactionGenome-Transcriptome-Proteome臨床應(yīng)用問題Disease marker-diagnosisDrug target-therapy,Proteomics,6,蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù),分離,Gel-based,Liquid-based,HPLC,FFE,SCX, RP, SEC,,,,,鑒定,MS,MALDI-TOF-MS,ES

3、I-MS,,MS-MS,,,,2D-HPLC,,MALDI-TOF-TOF,,MALDI-Q-TOF,,ESI-MS-MS,,,,LC-ESI-MS-MS,,計算機技術(shù),,,,7,IEF: isoelectric focusing (等電聚焦),2-DE:Two-dimensional gel electrophoresis,第一向基于蛋白質(zhì)的等電點不同用等電聚焦分離;第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離, 把復雜蛋白

4、混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開,HPLC:High-performance liquid chromatography or high-pressure liquid chromatography (高壓液相色譜法),DIGE:2-D difference Gel Electrophoresis,基本縮略詞,iTRAQ: Isobaric tag for relative and absolute q

5、uantitation 同位素標記相對和絕對定量,8,質(zhì)譜儀分為進樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器和檢測器四部分。離子源又分為:電子轟擊源 (Electron Ionization,EI)化學電離源 (Chemical Ionization,CI)場致電離源 (FI)電噴霧電離源 (Electro Spray Ionization,ESI) 等,MS是單級質(zhì)譜,適用于樣品不是特別復雜的樣品分析。 對于復雜樣品,單級質(zhì)

6、譜會出現(xiàn)很多干擾峰,影響測定。,MS:Mass Spectroscopy (質(zhì)譜),MS/MS是串聯(lián)四級桿質(zhì)譜,通過兩個質(zhì)量分析器間的碰撞室進行 一定能量的碰撞,選擇性的掃描碰撞后得到的子離子碎片,不符合 一定質(zhì)量數(shù)的離子被拋棄,這就降低了背景噪音、大大提高了檢測的 靈敏度和準確度。,基本縮略詞,9,ESI-MS:Electro Spray Ionization-Mass Spectroscopy,

7、 電噴霧質(zhì)譜,MALDI-TOF-MS:Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/ Time of Flight Mass Spectrometry 基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜, 是一種新型的軟電離生物質(zhì)譜,LC-

8、ESI-MS/MS: 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜,MALDI-TOF-TOF:基質(zhì)輔助激光解吸離子化-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜,MALDI-Q-TOF:基質(zhì)輔助激光解吸離子化-三級四級桿-飛行時間質(zhì)譜,基本縮略詞,10,PMF: Peptide Mass Fingerprinting (肽質(zhì)量指紋譜), 是蛋白質(zhì)被識別特異酶切位點的蛋白酶水解后得到的 肽片段的質(zhì)量圖譜,蛋白質(zhì)組學研究中,質(zhì)譜測序一般采用兩種方式:

9、一種是利用串聯(lián)質(zhì)譜 (MS/MS) 測序; 另一種是利用源后衰變 (PSD:post-source decay) 技術(shù)測序,基本縮略詞,IPG(EF):Immoblized pH gradients isoelectric focusing (固相pH梯度等電聚焦),11,PMF常用軟件,Mascot: www.matrixscience.com,Profound: Prowl.roc

10、kefeller.edu,PepIdent: www.expasy.ch/tools,ProteinProspector: Prospector.ucsf.edu,PepSea: 195.41.108.38,12,常用串聯(lián)質(zhì)譜檢索工具,SEQUEST: Field.scripps.edu/sequest,PepFrag: Prowl.rockefeller.edu,ProteinProspector: Prospector.ucsf.e

11、du,Mascot: www.matrixscience.com,13,基于2DE的差異蛋白質(zhì)組分析技術(shù)流程,14,Provides a hard-copy record of separationAllows facile quantitationSeparation of up to 3000 different proteinsHighly reproducibleGives info on Mw, pI and post

12、-trans modificationsInexpensive,Limited pI range (4-8)Proteins >150 kD not seen in 2D gelsDifficult to see membrane proteins (>30% of all proteins)Only detects high abundance proteins (top 30% typically)Time c

13、onsuming30% of spots with multiple proteins from pI 4-7,2DE:Advantages & Disadvantages,15,傳統(tǒng)的基于2DE的差異蛋白質(zhì)組學分析技術(shù),優(yōu)點:,①技術(shù)路線成熟,②重現(xiàn)性和直觀性好,③費用較低,④展示差異蛋白質(zhì)的PI和Mw,缺點:,①蛋白質(zhì)共遷移(comigration)問題,不適合于很復雜的樣品,②線性動態(tài)范圍較窄,③強疏水性,強鹼性,分子量

14、過大(?150kD)的 蛋白質(zhì)受到限制,16,基于Shotgun差異蛋白質(zhì)組分析技術(shù)流程,iTRAQ-LC-MS/MS,17,18,Alleviate some limitations of the 2-DE/MS methodGenerally high throughputProtein identification and quantification is straightforwardprocess is sim

15、pleCan be used to ID post-trans. modifications,Requires more handling for sample isotopic labeling Low reproducibilityRequires high level expertiseShowed biases for high Mr proteins and against certain types and cla

16、sses of proteins,Advantages Disadvantages,Shotgun:Advantages & Disadvantages,19,Sensitivity and dynamic range of protein analysis methods,20,IPG(EF):Immoblized pH gradients isoelectric focusing(固相pH梯度等電聚焦),建

17、立于20世紀80年代,一種新型等電聚焦技術(shù)。利用一系列具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物滴定,在滴定終點形成pH梯度并參與丙烯酰胺的共價聚合。,優(yōu)點:與傳統(tǒng)兩性電解質(zhì)等電聚焦相比,具有分辨率更高、上樣量更大。 分辨率可達0.001pH, 是目前分辨率最高的電泳方法,可用于等電點及其附近的蛋白質(zhì)和多肽的分析、制備,特點:形成固定的、不隨環(huán)境電場等條件變化的pH梯度,21,使用寬pH范圍的膠條(pH 3-10)可以

18、在同一塊凝膠上看到樣品中絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)。將有重疊區(qū)域的窄pH梯度的膠條聯(lián)合使用,也同樣可以得到整個pH 3-10范圍的結(jié)果。因為絕大多數(shù)蛋白聚焦在pH 3-10的中間區(qū)域,所以研究人員有時選用非線性梯度的膠條,這種膠條將兩端的pH梯度壓得很窄,卻可以使中間區(qū)域的蛋白質(zhì)得到較好的分離。將窄pH梯度的線性IPG膠條重疊使用,效果要比用非線性膠條好得多,它可以檢測出樣品中更多的蛋白質(zhì)斑點。,pH 梯度范圍的選擇,22,常用蛋白酶

19、抑制劑,23,優(yōu)點: ①樣品和對照之間的差異蛋白質(zhì)展現(xiàn)在同一膠上,能直觀可靠確定; ②對isoform 的定量較準確; ③比傳統(tǒng)2DE動態(tài)范圍有所增加.缺點: ①標記效率低只Lys的氨基的1%左右; ②受限于2DE的分離能力; ③受蛋白質(zhì)在2DE上共遷移現(xiàn)象的影響,可能對復雜樣品的isoform定量產(chǎn)生影響.,2-D Difference Gel Electrophoresis (DIGE)

20、,24,Cys-labelingModify before digestHigh probability of losing PTM,缺點: ①只標記Cys,沒有Cys的蛋白質(zhì)得不到鑒定。②純化含Cys肽段時,有效肽段損 失巨大(達90%)。③ICAT 分子量大,對于較小肽段影響數(shù)據(jù)庫的搜索。④2H, 1H 標記的肽段在反相分離時表現(xiàn)出輕微的洗脫時間不 一致現(xiàn)象,使得定量困難.,ICAT Wor

21、kflow (技術(shù)流程) [補充],優(yōu)點: ① 克服了2DE方法相應(yīng)的缺點。 ② 只鑒定含cys的肽段,減少了質(zhì)譜分析的復雜程度。,25,Isobaric labeling: N-term + LysModify after digestRequires MS/MS measurements,優(yōu)點: ①全標記,范圍廣,靈敏度高于ICAT。 ②可以做絕對定量。,缺點: ①需要MS/MS分折后才能定量; ② 酶解后標記樣品復雜程 度高;

22、 ③只適合LC-MALDI-TOF/TOF或LC-MS/MS。,iTRAQ Workflow (技術(shù)流程) [補充],26,The mass difference between labelled (12C/13C) and unlabelled peptides are 105.0215Da/111.0419 Da for each modified amino group: Lys + Protein N-t

23、erm.Dm = 6.0204 Da/mod Lys residue,優(yōu)點: ①蛋白水平標記,全標記NH2,范圍廣,靈敏度高,有利于兼容其它蛋白 質(zhì)的分離分法如2DE,SDS-PAGE等。②所有的質(zhì)譜都可以分析,包括離子阱。缺點:需要用除Trypsin 以外的酶切,以提高蛋白質(zhì)的鑒定率和定量率。,ICPL Workflow (技術(shù)流程) [補充],ICPL Reagent Structure,27,Acid Cleav

24、able ICAT Reagents (ABI) [補充],優(yōu)點:①移去了親和基因使標記的肽段分子量整體減小,提高了質(zhì)譜分析中的效率和 降低了數(shù)據(jù)庫搜索的復雜性。②標記在C上使得共流出時間一致。缺點:同ICAT試劑差不多。,28,SILAC Workflow (技術(shù)流程) [補充](Stable isotope labeling with amino acids in cell culture),優(yōu)點:①

25、省去了體外標記化學反應(yīng)和分離純化步驟, 有利于低豐度蛋白質(zhì)的檢測定量。 ② 完全兼容任何傳統(tǒng)的蛋白分離手段。,缺點:① 不能對組織樣品進行分析定量。 ② 培養(yǎng)細胞在富含穩(wěn)定同位素介質(zhì)中生長, 可能會影響細胞的繁殖,由此改變蛋白質(zhì)的 表達水平。 ③ 昂貴。不適用于人體樣品。,29

26、,Enzymatic labeling: trypsin catalyzed O16 to O18 exchange [補充],優(yōu)點:① 方便對MS/MS掃描時Y系列離子的識別。② 簡單,快速。 ③ 完全標記,不帶傾向性。④ 不會丟失翻譯后修飾信息。,缺點:① 不穩(wěn)定。 ② 完全標記后肽段只相差4Da。,30,Label-free strategies:Extracted ion current (XIC)-bas

27、ed quantification [補充],優(yōu)點:① 可準確定量。② 不需標記,可對任何樣品進行定量。③ 不丟失任何修飾信息。,缺點:① 在樣品定量分析時,容易出錯。② 需做平行的兩次實驗,對儀器,環(huán)境等要求高。 ③ 不適合時,兩個獨立的樣品進行多次純化。,31,Peptide ions from more abundant proteins would be selected more frequently i

28、n MS spectrum.,LC-MS/MS,Spectral counts OR number of peptides identified for each protein,根據(jù)spectral counts 的數(shù)目直接估計豐度或根據(jù)公式計算出一個豐度值,例子: emPAI =10PAI-1,where PAI is the number of observed peptides divided by the number of

29、 theoretically observable peptides. M.Mann et al MCP 4.9 1265-1272,,,Semiquantification: Spectral counts [補充],優(yōu)點: 簡單,直接,多用于單個復雜樣本內(nèi)蛋白質(zhì)之間的相對定量.,缺點: 尚無報道用于兩個樣本之間蛋白質(zhì)的定量;不同樣本、不同LC-MS/MS之間的比較不太準確.,二、血漿/血清蛋白組學,32,(Human Plas

30、ma Proteome Project,HUPO PPP),33,HUPO PPP,2001.10. 國際人類蛋白質(zhì)組組織(Human Proteome Organization, HUPO),在美國成立。啟動人類蛋白質(zhì)組計劃(HumanProteome Project, HPP).,HPP的主要研究目的:鑒定人類基因組編碼的全部蛋白質(zhì)及其功能;揭示: 構(gòu)成各種人類組織不同細胞類型的蛋白質(zhì)表達譜; 蛋白質(zhì)組翻譯后修飾譜; 蛋白

31、質(zhì)組亞細胞定位圖; 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系圖; 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系圖,34,HPP首批執(zhí)行計劃:人血漿蛋白質(zhì)組計劃 (Human Plasma Proteome Project,HUPO PPP)人肝臟蛋白質(zhì)組計劃 (Human Liver Proteome Project,HLPP ),HUPO PPP由美國科學家Gilbert Omenn牽頭十多個國家/地區(qū)、57個實驗室參與,HUPO PPP,35,HUPOPPP的

32、先期(pilot phase)目標: 比較不同樣本收集、處理和儲存過程對蛋白質(zhì)分析的影響; 通過分析血漿蛋白質(zhì)組,比較不同蛋白質(zhì)組分析技術(shù)平臺的 敏感性和局限性; 比較不同高豐度蛋白去除(depletion)方法,以及去除與否 對蛋白鑒定的影響; 數(shù)據(jù)提取、整理和儲存的標準化,目的: 全面認識人類正常血漿/血清中的全部表達蛋白 全部表達蛋白在不同生理條件下的變異度,HUPO PPP,36,人血漿/血清蛋白質(zhì)組

33、學研究的特別意義,Gilbert Omenn,2006.12人血漿蛋白質(zhì)學的專著,37,人血漿/血清蛋白質(zhì)組學研究的獨特地位,人血液中蛋白質(zhì)的來源幾乎與所有細胞、組織、器官有關(guān) 人血液中蛋白質(zhì)可以直接反映機體的病理、生理狀態(tài)。即機體中的 每一個細胞都可能將反映其生理狀態(tài)的記錄,以排泄物或信號分子的 形式釋放到血液中 人血液中蛋白質(zhì)是發(fā)現(xiàn)各種疾病相關(guān)的已知和/或未知生物標志物的 最有價值的標本,常

34、規(guī)的血液檢查僅僅能反映血液所攜帶信息中的很少的部分;在疾病的早期診斷方面,迫切需要發(fā)現(xiàn)更有效的疾病標志物, 但迄今為止,公認的新的疾病標志物的數(shù)量極少。,38,人血漿蛋白質(zhì)總況,血漿大約含有7%的蛋白質(zhì),1%的其它物質(zhì),92%的水分。 這些蛋白質(zhì)包括維持機體正常生理狀態(tài)的蛋白質(zhì),各種病理、 生理狀態(tài)下機體細胞和組織分泌、脫落的蛋白質(zhì),血漿蛋白質(zhì)總數(shù)估計在10,000種甚至更多,所含蛋白總量達到60-80mg/m

35、l。血漿中總蛋白量的99% 由為數(shù)不多的22種高豐度蛋白所占有,血漿中蛋白質(zhì)濃度在一個高動態(tài)范圍內(nèi)(9~12個數(shù)量級)變動 —— 從35~50 mg/ml的血清白蛋白,到1–10 pg/ml或更低的趨化因子,39,人血漿蛋白質(zhì)組的組成,a. 組成性蛋白 主要指肝臟和小腸的分泌蛋白,它們在血漿中發(fā)揮作用, 如白蛋白,纖維蛋白原等b. 免疫球蛋白 血漿中大約含有數(shù)百萬種抗體,血漿蛋白根據(jù)其來源和功能

36、可分為:高豐度蛋白和低豐度蛋白,高豐度蛋白:,40,低高豐度蛋白,c. 組織滲漏蛋白:組織新陳代謝或發(fā)生病理改變導致細胞損傷、 死亡而進入血液的蛋白質(zhì),可用于疾病的診斷及愈后評價 如心肌鈣蛋白(cardiac troponins),或心肌球蛋白(myoglobin) 用于診斷心肌梗塞,d. “遠距離”受體和配體:肽類及蛋白質(zhì)類激素,如胰島素等 生長因子;臨時信使,如非激素類的蛋白,e. “局部”作用的受

37、體和配體:細胞因子及細胞反應(yīng)調(diào)節(jié)因子, 如IL-8,f. 一過性通過蛋白:如脂蛋白、溶酶體蛋白酶,g. 異常分泌蛋白:如前列腺特異性抗原(PSA)等腫瘤 相關(guān)蛋白,41,意義:認識疾病演變過程,分離疾病特征標志和藥物靶標如:細胞死亡或損傷后被釋放到血漿中的組織滲漏蛋白, 腫瘤或其他病變器官釋放到血漿中的異常分泌蛋白等,特點:種類繁多,性質(zhì)各異,作用重要,分離和鑒定相當困難,h. 外來蛋白:如異常微生物、

38、寄生蟲、病毒的病原蛋白 及其釋放的蛋白,i. 小分子量的蛋白及多肽組份:主要是細胞因子、 多肽類激素及較大蛋白的酶解片斷,42,A. 人血漿中十種豐度最高的蛋白質(zhì),它們占有總蛋白質(zhì)量的大約90%。,B. 人血漿中十二種豐度較高的蛋白質(zhì),它們占有總蛋白質(zhì)量的大約9%。,占總量的1%,其數(shù)量多、含量低,但最受關(guān)注。,54.31%,16.61%,3.32%,3.64%,3.83%,1.98%,3.45%,2.94%,1.12

39、%,43,血漿蛋白組成復雜,蛋白豐度水平差異巨大,44,,45,從相對分子質(zhì)量的分布看,10~100 kDa的蛋白質(zhì)占有相當大的比例,其中: 18% < 20 k Da 69% < 60 k Da,289種血漿蛋白的分子量大小分布,46,人血漿蛋白是血漿中的所有蛋白質(zhì)統(tǒng)稱,來源廣、 組成復雜、種類與數(shù)量多,人血漿/血清蛋白質(zhì)組學研究的特殊性,人血漿蛋白質(zhì)性質(zhì)的動態(tài)范圍廣,對定量檢測要求高,人血漿蛋白中的

40、高豐度蛋白對與疾病關(guān)系更密切的 低豐度蛋白研究的干擾大,人血漿蛋白質(zhì)受取材方式的影響較大,血漿蛋白的不穩(wěn)定性,數(shù)據(jù)間的可比性差,47,血漿/血清蛋白質(zhì)組研究中需要著重注意的問題,1、樣品的選擇,2、樣品的收集與貯存,3、去除高豐度蛋白和分級技術(shù),4、多維策略的運用,48,蛋白質(zhì)組學研究中,選用血清或血漿的結(jié)果差異很大,樣品的選擇,血漿和血清的形成方式不同,所含蛋白的種類與數(shù)量不同血清:纖維蛋白被凝結(jié)去除,與纖維蛋白結(jié)合的蛋白被損

41、失; 凝結(jié)過程中血細胞元素釋放大量肽段血漿:抗凝劑 (EDTA、枸櫞酸、肝素) 的選擇影響研究結(jié)果, 尤其是對細胞因子的影響大,分析低分子量的蛋白質(zhì)時: 適于選用去除血小板的EDTA血漿或枸櫞酸血漿樣品,肽組學研究時: 最好選用去除血小板的血漿,49,樣品的收集與貯存,收集管: 商品化收集管含有多種成分可能干擾或混淆質(zhì)譜測定; 可能含有一些促凝或抗凝物質(zhì);

42、可能會吸附一些低豐度蛋白,干擾血漿/血清中低豐度蛋白的鑒定,抗凝劑種類,血清凝集時間,血漿孵育時間和溫度,貯存: 室溫4小時或6小時,血樣品變化很小 8小時后、特別是24小時后質(zhì)譜分析結(jié)果有明顯變化 4℃下的結(jié)果與室溫下結(jié)果差不多,時間推移到48小時或96小時, 變化非常顯著;長期存放在-20℃,-80℃,或液氮中沒有太大的變化反復凍融次數(shù)增加卻有很大影響,50,樣品的貯存與結(jié)果,Marshall et

43、 al., 2006,51,1)血漿或血清參考樣本收集處理必須在2h小時內(nèi)完成;2)血漿采用用加入1.0ml枸櫞酸鈉(0.105mol/L)抗凝劑(與血的比例為1:9)或者采用噴霧干燥的EDTA為抗凝劑;血清在室溫下30min內(nèi)用微粉硅膠促凝后分離。分別收集10ml。3) 分離在2-6℃下操作(枸櫞酸血漿,血小板計數(shù)要小于130/ul) 。離心后混合即分裝到250ul硅烷化EP管中,-70℃保存。,4) 無HIV、HBV、HCV、

44、HTLV-1 (人類T細胞親淋巴病毒1型)、 梅毒,無任何肝損傷。5)整個過程不加cocktail等蛋白酶抑制劑。6)所有供血者應(yīng)清晨空腹取血;24h內(nèi)無服藥和酒。此后的血漿蛋白質(zhì)組學研究大多 采用了這一套程序。,Tirumalai R.S., Chan K.C., Prieto D.A.,et al. Mol Cell Proteomics.2003,2: 1096-1103,HUPO PPP在先期研究中采用的統(tǒng)

45、一樣本標準,52,4℃下處理血液標本,2h內(nèi)盡快分離血清及細胞;用U9緩沖液 (9mol Urea, 2%CHAPS, 1%DTT) 稀釋血清后,可以24h內(nèi)在室溫下運送或?qū)ρ寮癢CX(弱陽離子交換)磁珠結(jié)合過程進行操作;血清應(yīng)分裝并長期儲存在-80℃或液氮,但限凍融1次;溶血標本應(yīng)棄用,建議重新取血。,劉建棟 等?;A(chǔ)醫(yī)學與臨床, 2007, 27(2)193-197,CHAPS: 3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸,

46、 兩性離子表面活性劑DTT: 二硫蘇糖醇(dithiothreitol), 還原劑,用于蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的血液標本的處理、運送、操作及儲存的標準建議條件,53,高豐度蛋白的去除和分級技術(shù),54,高豐度蛋白嚴重干擾了低豐度蛋白的檢測,A: AlbuminB: TransferrinC: Apo A-I lipoproteinD: Haptoglobin b-chainE: a1-Antitrypsin,PPI Website

47、Oct 2002©,Plasma Proteome Institute,55,未去除高豐度蛋白的肝癌患者血漿的2-DE分離結(jié)果,去除高豐度蛋白的肝癌患者血漿的2-DE分離結(jié)果,高豐度蛋白嚴重干擾了低豐度蛋白的檢測------肝癌患者血漿去除高豐度蛋白前后2-D分離結(jié)果,56,高豐度蛋白的去除策略,親和色譜柱技術(shù)對高豐度蛋白進行選擇性分離,抗體的親和法,染料的親和法,,抗體親和法利用抗原抗體反應(yīng)的原理,用針對血漿中多種高

48、豐度蛋白的單克隆或多克隆抗體來特異性去除血漿中的高豐度蛋白,染料親和法通過高豐度蛋白與染料環(huán)結(jié)構(gòu)之間復雜的靜電、疏水及氫鍵相互作用去除血漿中的高豐度蛋白。特異性相對較低。,57,,,正常人血漿,MARS親合柱(結(jié)合組分-BF、流出組分-FF),結(jié)合組分、流出組分蛋白的胰蛋白酶切,肽段的陽離子交換色譜分離,反相色譜分離-離子阱質(zhì)譜鑒定,Sequest軟件數(shù)據(jù)檢索,,,,,,,,,,,,SepproTM MIXED12親合柱(結(jié)合

49、組分-BF、流出組分-FF ),,,,數(shù)據(jù)整合與分析,,去除血漿高豐度蛋白的技術(shù)路線,58,HPPP,Attempts for the depletion of high abundant proteins,59,多重親和去除系統(tǒng)進行免疫去除前后的猴血漿2DGE圖譜,安捷倫高豐度蛋白去除柱 (MARC),60,商業(yè)化的多重親和去除血漿高豐度蛋白的分離系統(tǒng),ProteomeLab IgY蛋白質(zhì)組分組分離系統(tǒng)(Beckman Coult

50、er 公司),ProteoExtract Albumin/IgG高豐度蛋白去除試劑盒 (MERCK公司),Aurum?Serum高豐度蛋白去除試劑盒(Bio-Rad公司),Agilent Multiple Affinity Removal Column (MARC)安捷倫高豐度蛋白去除柱 (安捷倫公司),ProteoPrep® 20 Plasma Immunodepletion Kit (PROT-20)去除血漿中20種

51、高豐度蛋白 (Sigma-Aldrich公司),61,血清/血漿高豐度蛋白清除柱,A,B,問題:清除柱是否僅去除特異的高豐度血漿蛋白?,各抗體以特定比率混合裝填成色譜柱,62,血漿蛋白組成復雜,蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)各有利弊,單一技術(shù)平臺不能達到最佳分離效果。,血清/血漿蛋白組學研究的多維策略,聯(lián)合使用不同技術(shù)平臺并加以適當改進是目前最通用的手段主要包括:去除高豐度蛋白樣本預分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)質(zhì)譜鑒定系統(tǒng),63,血清/血漿蛋白組學

52、研究的多維策略,獲得了325個完整的蛋白質(zhì),高豐度蛋白去除+色譜分離+2-DE+聯(lián)合質(zhì)譜鑒定,兩名健康男性血清,免疫親和吸附法去除血清8種主要的高豐度蛋白,色譜預分離(pre-fractionation), 離子交換色譜(anion-exchange chromatography,AEC) 分子篩色譜(size-exclusion chromatography,SEC),2-DE分離富集的低豐度蛋白組分(fraction

53、s),近3700個蛋白質(zhì)點,MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定,LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜進一步分析未能鑒定的蛋白質(zhì)點,,,,,,,,Pieper R. et al. 2003, Proteomics, 3(4):422-432,64,血清/血漿蛋白組學研究的多維策略,鳥槍測序法(Shotgun sequencing),即高豐度蛋白去除 + 全蛋白酶解 + 二維液相色譜(陽離子/陰離子交換色譜 + 反相色譜)分離 + 質(zhì)譜

54、鑒定(離子阱或Q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜),Adkins JN. et al. 2002, Mol Cell Proteomics, 1(12):947-955,女性志愿者血清,protein A/G吸附去除免疫球蛋白,胰蛋白酶對血漿全蛋白酶解,強陽離子交換(strong cation exchange, SCX)反相(reversed phase)色譜分離,電噴霧液相離子阱質(zhì)譜(LCQ Ion Trap)鑒定,490種不同血漿蛋白,蛋白質(zhì)鑒

55、定效率提高了3-5倍,,,,,,操作繁雜,自動化程度比較低影響因素較多穩(wěn)定性有待提高,65,血清/血漿蛋白組學研究的多維策略,血漿全蛋白預分離(色譜聚集+反相高壓液相色譜) + 組分胰蛋白酶酶解 + 串聯(lián)質(zhì)譜鑒定 (LC-ESI-MS-MS或2D-micro-LC+MALDI-TOF-TOF-MS ),Beckman Coulter公司于2003年下旬推出ProteomeLab PF 2D system完整血

56、漿蛋白預分離系統(tǒng),血漿蛋白先經(jīng)多維色譜分離,分離組分經(jīng)胰蛋白酶酶解,質(zhì)譜鑒定,,,克服了2-DE的缺點,操作簡單,自動化程度高,簡化了信息處理提高了低豐度蛋白質(zhì)、膜蛋白、分子量特別大和特別小的蛋白質(zhì)的分離檢測能力回收率高,能保持蛋白質(zhì)的完整性和活力。,66,血清/血漿蛋白組學研究的多維策略,多重窄pH范圍2-DE+聯(lián)合質(zhì)譜鑒定(MALDI-TOF+LC-MS/MS),Starita Geribaldi M et al. 2003,

57、Proteomics, 3(8):1611-19,使用相差1個pH范圍的多重固相pH梯度干膠條,大大提高了傳統(tǒng)2-DE的分離效率,MALDI-TOF + LC-MS/MS聯(lián)合質(zhì)譜分析,蛋白質(zhì)鑒定的效率增長兩倍,極酸和極堿性蛋白質(zhì)的分離和鑒定效果↑,,,67,血清/血漿蛋白組學研究的多維策略,非變性等電聚焦預分離 + 變性等電聚焦預分離 + 1D分離 + 質(zhì)譜鑒定(LC/MS/MS ),Giometti在非變性條件下(不破壞

58、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu))進行二維電泳分離,分離到的蛋白質(zhì)仍然保持原始狀態(tài),使蛋白質(zhì)生物功能和蛋白質(zhì)之間相互作用的檢測成為可能,克服了傳統(tǒng)2-DE (采用變性條件)的缺陷,Manabe等通過采用非變性二維電泳與變性二維電泳相結(jié)合的方法,血漿中分離,鑒定出多個IgG結(jié)合蛋白,68,血清/血漿蛋白組學研究的多維策略,SELDI-TOF分離 + Q-TOF質(zhì)譜鑒定,表面增強激光解吸/離子化 -飛行時間質(zhì)譜(surfaceenhanced laser

59、desorption/ionization-time of flight,SELDI-TOF)是一種以固相表面親和為基礎(chǔ)的質(zhì)譜分離技術(shù),完整血漿蛋白先經(jīng)過與不同親和表面(化學表面芯片和生物表面芯片)結(jié)合純化,SELDI質(zhì)譜分離,Q-TOF質(zhì)譜鑒定,差異蛋白質(zhì),尤其是小分子蛋白,血漿蛋白的分離和鑒定中與上述其他技術(shù)具有很大的互補性,用于疾病相關(guān)的血漿蛋白質(zhì)組研究,,,,,69,血清/血漿蛋白組學研究的多維策略,進行OGE之前用免疫方

60、法去除6個血漿中的主要蛋白質(zhì),用1.5 mg分離組分,順利獲得81種蛋白質(zhì),其中仍有1個免疫球蛋白,脫離凝膠電泳(Off-gel electrophoresis,OGE)技術(shù),Heller M. et al, 2005, Electrophoresis, 26(6):1174-88,應(yīng)用OGE技術(shù)經(jīng)2個步驟將完整的蛋白質(zhì)和肽段分解成散在的液態(tài)片段,LC-MS/MS分析肽片段,用1.5 mg人血漿蛋白獲得了53個蛋白質(zhì),其中10個為不同的

61、免疫球蛋白,12 mg人血漿蛋白,獲得73個蛋白,其中15個與免疫球蛋白相關(guān),處于試驗階段,70,血清/血漿蛋白組學研究中多維策略的優(yōu)勢,,2D,,,,1D,3D,4D,Plasm/Serum,Plasm/Serum,Plasm/Serum,Plasm/Serum,,1 LC-MS/MSrun,,,,20-40 LC-MS/MS runs,100-150 LC-MS/MS runs,100-150 LC-MS/MS runs,,,,,

62、,1D SDSPAGE,MicroSol-IEF,,1D SDSPAGE,1D SDSPAGE,MicroSol-IEF,Major ProteinDepletion,,,,,,,,,,,~100,~800-1000,~2000+,~2800+,,,,,UniqueProteins,MicroSol-IEF:microscale solution IEF 微量等電聚焦電泳,71,血清/血漿蛋白組學研究的臨床應(yīng)用,生物標志物

63、的識別,淀粉樣變和沉積疾病,遺傳性疾病,免疫蛋白質(zhì)組學,脂質(zhì)組學,降解組學和多肽組學,72,血清/血漿蛋白組學研究的臨床應(yīng)用,淀粉樣變和沉積疾病,遺傳性疾病,免疫蛋白質(zhì)組學,脂質(zhì)組學,淀粉樣變病(amyloidosis)是指一些以β折疊結(jié)構(gòu)的纖維蛋白(鑒定成分)為主的淀粉樣物質(zhì)在器官組織細胞外沉積所引起的疾病,如先天性糖代謝缺乏綜合征,識別組織相容復合物(MHC)、特異抗體的抗原、外源病毒或疾病產(chǎn)生的蛋白,識別脂蛋白及結(jié)合蛋白,73

64、,血清/血漿蛋白組學研究的臨床應(yīng)用,降解組學和多肽組學,識別與鑒定與疾病、生物過程中蛋白代謝特異相關(guān)的多肽,生物標志物 (Biomarkers),生物標志物現(xiàn)特指疾病或機體狀態(tài)的信息指標,如基因序列或突變、mRNA 表達譜或組織蛋白等。主要指正常生物學過程、致病過程或干預療法的藥理反應(yīng)等過程的一種生物指標,FDA在“藥物基因組學“提出”有效生物標志物““有效生物標志物”是一種得到廣泛認可的,具有生理學、毒理學、藥理學或者臨床意義

65、的指標”,74,血清/血漿蛋白組學研究的臨床應(yīng)用,理想的生物標志物具有的特點,與疾病發(fā)生、發(fā)展機制緊密相關(guān):具有較好的診斷、危險性分類 和預后評估的價值,真實性 ①具有良好的靈敏度和特異性②具有可預測性 常用預測值 (predictive value,PV) 表示,包括陽性預測值(PPV) 和陰性預測值 (NPV)③能有效地用于臨床疾病的分型,檢測方法可實現(xiàn)標準化 易于掌握和推廣應(yīng)用,具有非創(chuàng)傷性,適

66、合于高通量分析,費用適當,75,Petricoin等用疏水型芯片結(jié)合并分離了卵巢癌患者血漿相關(guān)蛋白,在腫瘤和健康血清之間發(fā)現(xiàn)了5個差異明顯的蛋白質(zhì)峰,它們共同構(gòu)成卵巢癌診斷模型,用該模型對腫瘤和健康人血漿進行盲篩,該模型診斷腫瘤的敏感性為100%,特異性為95%,血清/血漿蛋白組學研究的實例,76,Li等選用金屬離子鰲合芯片結(jié)合并分離乳腺癌血漿蛋白,發(fā)現(xiàn)3個乳腺癌特異的差異蛋白峰。用這3個特異蛋白標志盲篩一組乳腺癌和健康人血漿

67、蛋白,乳腺癌檢出的敏感性為93%,特異性為91%,血清/血漿蛋白組學研究的實例,77,三、尿蛋白質(zhì)組學,Urinary Proteomics,78,尿蛋白質(zhì)組學研究的獨特地位,標本獲得上:方便、無害、量大,保存上:相對穩(wěn)定,尿液中的蛋白質(zhì)組成,可溶性蛋白固相成分,正常人的尿液中存在1500種以上的蛋白質(zhì),來源于大蛋白質(zhì)分子裂解的大量多肽片段,79,尿蛋白質(zhì)的來源:可溶性蛋白,80,尿蛋白質(zhì)的來源:固相成分,注1:上皮細胞包括尿足細胞

68、(urinary podocytes)、尿道上皮細胞在內(nèi)的各種泌尿器管道的 上皮細胞,81,尿蛋白質(zhì)組學的研究意義,in the early diagnosis of disease in classification of disease with regard to likely therapeutic responses in assessment of prognosis in monitoring re

69、sponse to therapy,These approaches have potential value, not only in diseases of the kidney and urinary tract, but also in systemic diseases that are associated with circulating small-protein and peptide markers that can

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