甲醛吸入染毒致大鼠肺損傷的蛋白質組學研究.pdf

1、甲醛是一個普遍存在的化學物，在服裝、食物、室內(nèi)空氣、汽油和柴油尾氣等中無所不在。它屬于揮發(fā)性有機化合物，溶液的沸點是-19℃，在室溫時極易揮發(fā)，氣態(tài)甲醛對人體健康危害更大。其健康危害主要包括感官刺激、過敏反應和各種基因毒性。大鼠長期吸入實驗已表明甲醛是一個鼻致癌物。2004年WHO將其由2A致癌原提升為1A致癌原，即“確認的人類致癌原”。目前，氣態(tài)甲醛毒性效應是明確的，但其分子機制研究很不深入。根據(jù)現(xiàn)有資料分析，甲醛的健康危害一般與大分

2、子蛋白質有關，因此，本文擬應用蛋白質組學方法來探索甲醛的毒性效應機理，并在蛋白質水平上來尋找其接觸與效應的生物學標志物。 隨著2003年4月14日人類基因組計劃的成功完成及后基因組時代的到來，蛋白質組的研究已成為生命科學發(fā)展的一個重要領域。“蛋白質組”一詞是澳大利亞Macquaire大學的Wilkins和Williams于1994年提出，“指一個基因組表達的全部蛋白質”。功能蛋白質組概念的提出為我們進行蛋白質組研究提供了依據(jù)。目

3、前，有關甲醛的研究主要是環(huán)境監(jiān)測與流行病學調查，分子水平上多集中于DNA損傷研究，尚無蛋白質組水平的研究報道。 呼吸系統(tǒng)是甲醛毒性作用的主要靶點。有資料顯示，甲醛吸入染毒后，大鼠肺內(nèi)甲醛含量比血、腦、肝、腎中高。但目前有關甲醛的研究多集中于上呼吸道，尤其是鼻腔，吸入暴露引起的肺損害研究非常有限。本研究的目的是應用蛋白質組學方法分析大鼠吸入甲醛后其肺內(nèi)的蛋白質改變，并對蛋白質改變的機制和功能進行探討和研究。結果如下： 1、

4、建立了正常大鼠肺蛋白質組雙向電泳(2-DE)技術。通過對蛋白定量、樣品制備、第一向和第二向電泳中的各個實驗環(huán)節(jié)進行控制和優(yōu)化，獲得了分辨率和重復性均較高的蛋白質2-DE圖譜。正常大鼠肺在18cmpH=3-10L的膠上可分離大約720個點，且分離效果較好；蛋白質點平均匹配率為72.2％。這一技術的建立，為后續(xù)工作奠定了基礎。 2、獲得了甲醛吸入染毒后大鼠肺蛋白質組2-DE差異表達譜。首先建立了大鼠不同濃度甲醛(0、15-20、32

5、-37mg/m3)亞急性(4h/d，15d)吸入染毒模型；其次獲得了甲醛吸入染毒后大鼠肺蛋白質組2-DE差異表達譜：肺樣品溶解并經(jīng)2-DE分離后，凝膠圖譜被掃描和分析以發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白質。在甲醛暴露組發(fā)現(xiàn)13個差異蛋白質點，其中4個在高濃度甲醛組顯著上調；2個在高濃度組顯著下調；4個只在高濃度組表達；1個在低濃度和高濃度組表達均顯著增高，呈現(xiàn)劑量-反應關系；2個在低濃度和高濃度組表達均顯著增高，但不呈現(xiàn)劑量-反應關系。 3、采用

6、質譜法鑒定了2-DE圖譜上的差異蛋白質點，并探討了這些蛋白質與甲醛毒性的關系。 通過膠內(nèi)酶切、MALDI-TOF-MS檢測和NCBInr蛋白質數(shù)據(jù)庫搜尋，成功鑒定6個蛋白質，分別為：醛糖還原酶、LIM蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、細胞內(nèi)氯離子通道3和細胞色素P450，其中有兩個蛋白質均為細胞內(nèi)氯離子通道3。對差異蛋白質中的醛糖還原酶進行了酶活性測試，結果與其在2-DE圖譜上表達量的變化一致。組織病理學研究表明，2-DE圖譜上甘油

7、醛-3-磷酸脫氫酶和細胞色素P450的表達變化與大鼠肺超微結構受損有關。 4、對醛糖還原酶(AAAR)表達升高的機制及其功能作了進一步研究。暴露于甲醛的大鼠由于活性氧的形成和抗氧化能力的下降可產(chǎn)生氧化應激，而AR表達增高可能減少由于氧化應激所致的大鼠肺損害。通過細胞培養(yǎng)、AR活性測定、流式細胞儀檢測細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)抑制AR可使大鼠肺細胞凋亡增加，因而認為AR具有抗氧化作用，對大鼠肺細胞具有保護功能。 總之，應用蛋白質組學方