大鼠皮質(zhì)原代星形膠質(zhì)細胞液壓沖擊損傷前后蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、目的：建立體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞液壓沖擊損傷模型，觀察星形膠質(zhì)細胞液壓沖擊前后形態(tài)學改變和研究蛋白質(zhì)組表達變化情況，尋找差異性蛋白標志物。 方法：選新生24小時內(nèi)SD大鼠，取皮質(zhì)組織，經(jīng)第一次純化傳代后培養(yǎng)8-10天，隨機分為對照組及損傷后12h、24h和48h組，復制Scott′s細胞液壓沖擊損傷模型，進行細胞形態(tài)學觀察。采用雙向凝膠電泳技術(shù)分析星形膠質(zhì)細胞液壓沖擊損傷后不同時間點蛋白質(zhì)組表達的改變。 結(jié)果： 1

2、 星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)和純化：我們采用SD大鼠皮質(zhì)原代培養(yǎng)膠質(zhì)細胞進行研究，以模擬腦外傷時膠質(zhì)細胞蛋白質(zhì)組學的變化。新生的SD大鼠，分離皮質(zhì)，剝除腦膜，置于鹽平衡液，剪碎，彎管輕輕吹打分散細胞，過網(wǎng)篩，差速粘附去除成纖維細胞?；旌吓囵B(yǎng)至第9-12天待細胞融合后，置于37℃搖床中，200r/min 14-16h，以去除少突膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞。然后用0.25％胰蛋白酶消化傳代，接種于直徑為60mm培養(yǎng)皿中，接種密度為0.8×10<'5>/ml

3、，得到純化的星形膠質(zhì)細胞。采用GFAP抗體免疫組化(SP法)染色鑒定，通過計數(shù)，檢查培養(yǎng)純度。結(jié)果顯示培養(yǎng)的膠質(zhì)細胞純度達到95％以上。繼續(xù)培養(yǎng)7-8天，生長狀態(tài)良好，鋪滿瓶底，形成大致均一的扁平細胞層。此時的星形膠質(zhì)細胞狀態(tài)穩(wěn)定，可以進行沖壓損傷實驗。 2 體外培養(yǎng)細胞液壓沖擊損傷裝置穩(wěn)定性評價：液壓沖擊損傷模型所產(chǎn)生壓力的大小，通過記錄小室內(nèi)和有機玻璃管內(nèi)的壓力大小來反映。實驗證明，小室內(nèi)和有機管內(nèi)的壓力差別很大，兩者間存

4、在一線性關(guān)系：Y=4.4763X+0.2986，Y為有機玻璃管內(nèi)壓力，X為小室內(nèi)壓力。通過連接兩個壓力傳感器，分別測量在不同沖擊角度下兩處壓力的大小，造成細胞損傷力的大小以小室內(nèi)的壓力為準。有機管和小室內(nèi)壓力隨鐘擺打擊角度的增加而增大。 3 液壓沖擊損傷星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學改變：隨機將細胞分為對照、0.05MPa、O.1MPa、0.2MPa、0.4MPa、0.8MPa沖擊壓力組，損傷后換全液，半小時后在培養(yǎng)液中加入0.4％臺盼藍1

5、ml，混勻，光鏡下觀察。星形膠質(zhì)細胞隨著沖擊壓力的不斷升高，依次發(fā)生了腫脹、細胞連接斷開、皺縮、脫壁、小片狀脫壁、消融等顯著損傷壞死后形態(tài)學改變。沖壓損傷后PI/Hoechst33342(1:1)熒光雙染后，發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞隨著沖擊壓力的不斷升高死亡細胞比率有增高趨勢，而且在0.2MPa沖擊壓力組觀察到細胞凋亡。但是當壓力達到0.8MPa沖擊壓力后，死亡細胞數(shù)顯著下降，考慮是壞死損傷細胞已經(jīng)發(fā)生快速消融。 結(jié)合前部分實驗，得出

6、0.2MPa可以造成星形膠質(zhì)細胞中度損傷。隨機將細胞分為對照組，2h、4h、8h、12h、24h、48h組，分別給予0.2MPa沖擊壓力后，換全液，分別在2h、4h、8h、12h、24h、48h，加入1ml 0.4％臺盼藍，混勻，光鏡下觀察。在0.2MPa中重度沖擊壓力損傷后，星形膠質(zhì)細胞隨時間發(fā)生變圓、細胞連接斷開、皺縮、脫壁、胞膜破裂、恢復等顯著的形態(tài)學改變。光鏡下觀察，損傷最嚴重發(fā)生在2、4小時，到8、12小時細胞狀態(tài)趨于穩(wěn)定，開

7、始恢復了，到24、48小時已與對照組基本相同。 4 大鼠皮質(zhì)原代星形膠質(zhì)細胞液壓沖擊損傷前后差異蛋白質(zhì)譜分析：各組檢測到的總蛋白點數(shù)，對照組1179±89，12h組1279±113，24h組1233±73，48h組1256±132。損傷后共有32個蛋白質(zhì)點的相對強度與手術(shù)對照組相比有顯著性差異(P<0.05)，其中24個蛋白點與對照組相比在損傷組表達升高，有8個蛋白質(zhì)點與對照組相比在損傷組表達下降。 結(jié)論： 1 體外培