乙醇對(duì)大鼠原代大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP及Plk2表達(dá)的影響.pdf

1、研究目的：
　　 乙醇是世界范圍內(nèi)消費(fèi)最廣泛的物質(zhì)之一，在常見的20種毒品危害中位居第五位，扭轉(zhuǎn)乙醇相關(guān)的損害是公共健康的一個(gè)緊迫問題。腦星形膠質(zhì)細(xì)胞是繼血管內(nèi)皮細(xì)胞后受乙醇及其毒性影響的第一細(xì)胞屏障，人類長(zhǎng)期乙醇暴露會(huì)導(dǎo)致樹突和星形膠質(zhì)細(xì)胞不可逆性損傷，而神經(jīng)元胞體和大部分軸突未見不可逆性損傷，提示樹突及星形膠質(zhì)細(xì)胞的遠(yuǎn)端突起可能是乙醇毒性損傷的關(guān)鍵靶位。由于膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprot

2、ein，GFAP)含量呈短期乙醇暴露時(shí)增加而長(zhǎng)期暴露則減少的規(guī)律性應(yīng)答，且慢性乙醇處理的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞表面更趨于光滑，而當(dāng)結(jié)構(gòu)性需求強(qiáng)加于ASTs時(shí)GFAP不可或缺，由此推測(cè)GFAP與肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控存在必然的關(guān)聯(lián)，但目前對(duì)GFAP切入肌動(dòng)蛋白調(diào)控通路的機(jī)制目前還知之甚少。結(jié)合本組前期對(duì)突觸后神經(jīng)元及T細(xì)胞中Plk2-SPAR-肌動(dòng)蛋白通路的理解，本文在研究不同濃度乙醇暴露對(duì)大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞活性影響的基礎(chǔ)上，探討了星形膠質(zhì)細(xì)

3、胞GFAP變化與Plk2、SPAR表達(dá)間的聯(lián)系，明確Plk2-SPAR-GFAP途徑有助于深入理解乙醇毒性損傷的關(guān)鍵細(xì)胞靶位，有助于發(fā)展靶向膠質(zhì)突起和樹突可塑性的有效干預(yù)措施，這將有望恢復(fù)乙醇依賴患者的認(rèn)知能力，為乙醇依賴患者終止乙醇濫用提供明確的希望和動(dòng)力。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 體外培養(yǎng)新生大鼠原代大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞，采用GFAP免疫熒光染色法鑒定細(xì)胞純度后，用MTT法檢測(cè)不同濃度乙醇暴露對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響

4、:用終濃度為0mM、50mM、100mM、200mM、400mM、600mM、800mM的乙醇培養(yǎng)液分別處理2×104/孔的星形膠質(zhì)細(xì)胞24h、48h、72h。通過免疫熒光染色法觀察不同濃度乙醇暴露對(duì)GFAP表達(dá)的影響。應(yīng)用Real-timePCR從核酸水平檢測(cè)中間絲GFAP和Plk2及SPARmRNA的表的水平。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.新生大鼠原代大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度鑒定達(dá)95±1.64％
　　 2

5、.不同濃度乙醇對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響
　　 在乙醇處理24h的情況下，新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性變化與正常組比較，50mM與800mM乙醇處理組有差異性。
　　 在乙醇處理48h的情況下，與正常組比較，400mM、600mM與800mM乙醇處理組著差異性(P＜0.05)，而且600mM、800mM組呈顯著性差異(P＜0.01)。
　　 在乙醇處理72h的情況下，與正常組比較，400mM、600mM與80

6、0mM乙醇處理組有著差異性(P＜0.05)，而且400mM、800mM組呈顯著性差異(P＜0.01)。
　　 總體上，乙醇對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響存在先上升（活性增強(qiáng)）后下降（活性減弱）的趨勢(shì)。
　　 3.不同濃度乙醇對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞Plk2、SPAR及GFAPmRNA表達(dá)的影響
　　 在200mM乙醇處理的情況下，Plk2mRNA在10min時(shí)就較對(duì)照組明顯表達(dá)增多(P＜0.05)，30min時(shí)的量達(dá)高峰(P＜

7、0.01)，隨后依時(shí)間的推移，Plk2mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性的減少，在6h時(shí)與對(duì)照組已未見差異;
　　 SPAR在200mM乙醇作用mRNA的表達(dá)處于低谷，隨著時(shí)間的進(jìn)程，SPARmRNA的量開始回升，48h時(shí)，SPARmRNA表達(dá)增加至對(duì)照水平;
　　 在200mM乙醇作用下，GFAPmRNA的表達(dá)漸漸升高，但直至24h時(shí)才較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，48h表達(dá)進(jìn)一步增加，72h時(shí)表達(dá)與48h相似，維持于高水平

8、。
　　 結(jié)論：
　　 1.以不同乙醇濃度為刺激強(qiáng)度，不同暴露時(shí)間為刺激持續(xù)時(shí)間，當(dāng)刺激持續(xù)時(shí)間恒定時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)不同濃度的乙醇刺激均產(chǎn)生應(yīng)答，但應(yīng)答（細(xì)胞活性和GFAP）表達(dá)呈二階段效應(yīng)，即星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)乙醇暴露具有一定的抗性，超過一定限度，抗性消失。
　　 2.星形膠質(zhì)細(xì)胞Plk2-SPAR途徑對(duì)200mM乙醇暴露存在時(shí)間依從性應(yīng)答改變。
　　 3.200mM乙醇暴露的星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAPmRNA