原代大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞損傷后動態(tài)變化的蛋白質(zhì)學初步研究.pdf

1、該研究通過建立星形膠質(zhì)細胞損傷模型,利用雙向電泳技術(shù)獲取星形膠質(zhì)細胞損傷后差異表達蛋白,探求損傷后星形膠質(zhì)細胞的一系列應答反應及蛋白水平上的動態(tài)變化.我們采用原代脊髓膠質(zhì)細胞進行研究以模擬脊髓損傷時膠質(zhì)細胞蛋白質(zhì)組學的變化.新生的Wistar大鼠,分離脊髓,剝除脊膜,取出脊髓至解剖液,然后用煎刀煎碎,再用胰酶消化,輕輕吹打后吹散脊髓組織,差度離心法富集膠質(zhì)細胞.然后進行全脊髓混合培養(yǎng),混合培養(yǎng)至第12天后通過機械振搖、玻璃培養(yǎng)瓶反復貼壁

2、及調(diào)整接種密度等方法去除其它細胞,得到較純的星形膠質(zhì)細胞.我們采用GFAP免疫熒光方法標記膠質(zhì)細胞,通過記數(shù),檢查培養(yǎng)純度.為了研究星形膠質(zhì)細胞在脊髓損傷修復中的作用,需要建立能再現(xiàn)損傷和再生過程的實驗模型.在進行IPG等民聚焦時,我們最終確定30,000Vhr作為控制一向的條件.在SDS-PAGE凝膠電泳時采用了優(yōu)化后的凝及配制方法,同時在電泳時采用固定膠條位置的方法,提高了實驗的重復性.在該研究的染色程序中,所有染色時間均控制在4分

3、鐘以內(nèi).在星形膠質(zhì)細胞的雙向電泳圖譜中,70％以上的蛋白集中分布在MW30-69kDa的范圍內(nèi);約有60左右的蛋白集中分布在pI3.0-6.4的范圍內(nèi).同時也可看到脊髓星形膠質(zhì)細胞在損傷后的不同時間其蛋白表達表現(xiàn)出了差異,其中在損傷后的圖譜中有一定的相似性.該論文對大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞純化培養(yǎng)方法進行了改進,以使其能符合雙向電泳研究的需要,并從形態(tài)學及免疫熒光兩方面進行了驗證.同時新設(shè)計了星形膠質(zhì)細胞的機械損傷模型,使其無論在損傷程度還