急性大鼠脊髓損傷的蛋白組學(xué)初步研究.pdf

1、【目的】
　　通過比較裂解液法、TCA-丙酮法和酚抽提取法提取大鼠脊髓蛋白的效率，選擇最適合的大鼠脊髓蛋白提取方法；研究大鼠急性脊髓損傷前后差異表達的蛋白質(zhì)，分析這些蛋白質(zhì)生物學(xué)功能，為更加深入的了解脊髓損傷后復(fù)雜的病生理過程提供理論依據(jù)。
　　【材料和方法】
　　本實驗提取正常雌性Wistar大鼠T10前后1cm的脊髓組織，分別采用裂解液提取法、TCA-丙酮提取法和酚抽提取法提取脊髓蛋白，通過比較Bradford法測

2、量蛋白質(zhì)的濃度，SDS-PAGE電泳和雙向電泳分析提取蛋白的種類和數(shù)量，選擇適合大鼠脊髓蛋白提取的最佳方案。
　　成年雌性大鼠9只，隨機分成3組，每組3只。對照組不進行脊髓打擊，僅采用同等劑量進行麻醉，椎板切除后直接取材。實驗組采用 IMPACTOR MODEL-Ⅱ打擊器建立T10脊髓損傷模型（打擊力度為10g×25mm），根據(jù)取材時間的不同分成3h組和8h組。采用已經(jīng)建立的大鼠脊髓蛋白提取方案提取蛋白，通過雙向電泳技術(shù)分離各組提

3、取的蛋白；采用 PDQuest軟件分析和比較對照組和實驗組的膠圖，尋找上調(diào)或者下調(diào)差異表達的蛋白；采用MALDI-TOF/TOF對這些蛋白質(zhì)進行肽質(zhì)量指紋圖譜和二級質(zhì)譜鑒定；通過NCBI和UniProtKB數(shù)據(jù)庫對這些蛋白進行亞細胞定位和功能注解；STRING軟件對差異蛋白進行通路分析。
　　根據(jù)已建立的大鼠脊髓蛋白提取方案提取對照組，3h組和8h組蛋白質(zhì)，通過Western Blot技術(shù)對已鑒定的關(guān)鍵差異蛋白進行驗證。
　

4、　【結(jié)果】
　　1.與裂解液法和酚抽提取法相比，TCA-丙酮提取法提取蛋白在SDS-PAGE電泳上有更多清晰的條帶，在雙向電泳上有這更多的蛋白斑點，所以本實驗采用TCA-丙酮提取法為最佳大鼠脊髓蛋白提取方法。
　　2.實驗組和對照組相比，共有30個差異表達的蛋白。包括9個代謝相關(guān)蛋白，6個氧化應(yīng)激蛋白，5個神經(jīng)纖維束蛋白，3個骨架蛋白，3個能量相關(guān)酶，1個細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，3個其它。其中11個上調(diào)，19個下調(diào)。
　　3.