布魯氏菌膜蛋白組學(xué)研究及免疫蛋白的篩選鑒定.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis，簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的動(dòng)物源性傳染病，在我國(guó)被列為二類傳染病，主要引起人的波狀熱和慢性感染以及反芻動(dòng)物的不育和流產(chǎn)。盡管布病是一種古老的傳染病，但人們對(duì)它的認(rèn)識(shí)還很膚淺，很多問題還沒有得到解決，如布魯氏菌的致病機(jī)制、細(xì)胞內(nèi)的寄生機(jī)制、免疫機(jī)制，不同種宿主寄生的差異，以及布病的免疫預(yù)防問題等。隨著細(xì)菌蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，通過研究分析細(xì)菌蛋白質(zhì)的組成分布及功能，給揭示上述問題帶來了

2、福音。布魯氏菌的膜蛋白具有促進(jìn)對(duì)表面的黏附、轉(zhuǎn)運(yùn)溶質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)進(jìn)入細(xì)胞、輸出蛋白和大分子、允許細(xì)胞間信號(hào)交換、感受外部環(huán)境的變化、保持膜的穩(wěn)定和維持細(xì)胞內(nèi)相對(duì)于外周環(huán)境的高滲透壓等功能。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究分析布魯氏菌膜蛋白，比較不同種間膜蛋白的差異、篩選鑒定免疫原性蛋白，對(duì)于研究布魯氏菌的生物學(xué)分類、不同種間的關(guān)系，解釋不同種宿主寄生的差異，從而挖掘布魯氏菌毒力、免疫相關(guān)分子，闡明致病機(jī)制與免疫機(jī)制，進(jìn)一步研發(fā)新型疫苗均具有重要意義。<

3、br>　　 本研究用碳酸鹽和新兼性離子去污劑方法成功地提取了布魯氏菌的膜蛋白，進(jìn)行2-DE分離，獲得了很好的蛋白分離效果。在對(duì)布魯氏菌不同種的強(qiáng)毒株544A和16M進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究后發(fā)現(xiàn)，在pI4.0～7.0，MW6.5～100kDa的2-DE圖譜中共發(fā)現(xiàn)130個(gè)差別表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，液相串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)鑒定了31個(gè)蛋白點(diǎn)，獲得23個(gè)ORF，經(jīng)生物信息學(xué)分析，這些蛋白涉及能量轉(zhuǎn)化生成、代謝相關(guān)酶、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞膜合成

4、等。比較結(jié)果顯示544A和16M雖同為布魯氏菌的強(qiáng)毒株，但各自的膜蛋白表達(dá)顯示其在宿主環(huán)境中的代謝機(jī)制有明顯不同：1)兩者通過不同的能量生成與轉(zhuǎn)化功能蛋白表達(dá)上調(diào)，以供在惡劣的宿主細(xì)胞環(huán)境中逃逸生存，如544A的gabD、gltA、BruAb2_0325，16M的BMEⅠ0386、BMEⅡ0394；2)通過氨基酸代謝途徑544A有ureC在極酸環(huán)境的保護(hù)機(jī)制，16M有BMEⅠ1635在缺氮環(huán)境中的保護(hù)途徑；3)在544A中發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶

5、家族ubiG、假想ABC輸送胞質(zhì)糖結(jié)合蛋白、Omp31、過氧化氫環(huán)境中保護(hù)性酶ahpC、通用壓力蛋白BruAb1_1942等蛋白上調(diào)，為其適應(yīng)胞內(nèi)生存環(huán)境提供了生存條件，其中ahpC、ureC為已知的布魯氏菌毒力因子；在16M中上調(diào)的Dps已有研究證明其在16M、M5和Rev1不同的布魯氏菌強(qiáng)弱毒株中表達(dá)差異顯著，可能為潛在的毒力因子。4)另在兩種菌中均發(fā)現(xiàn)有上調(diào)的假定蛋白，如544A的BruAb1_1052、BruAb2_0291，1

6、6M的BMEⅡ092，在其他發(fā)表的差異蛋白質(zhì)組學(xué)文獻(xiàn)中也發(fā)現(xiàn)了不同的假定蛋白，這些蛋白沒有生物信息學(xué)的支持對(duì)其功能無法預(yù)測(cè)，但暗示著布魯氏菌中有很大一部分假定蛋白在它的胞內(nèi)生存中發(fā)揮著重要作用。因此對(duì)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株不同的致病分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，對(duì)于理解布魯氏菌的致病機(jī)制有重要的價(jià)值。
　　 本研究同時(shí)對(duì)544A的膜蛋白用布魯氏菌臨床陽(yáng)性牛、羊血清進(jìn)行了免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究。存pI4.0～7.0，MW6.5～100kDa的2-DE窗口

7、上，共發(fā)現(xiàn)19個(gè)共同具有免疫原性的蛋白點(diǎn)，通過LC-MS/MS質(zhì)譜分析和Mascot檢索，獲得19個(gè)ORF。19個(gè)蛋白中驗(yàn)證了一部分已知的免疫原性蛋白，也新發(fā)現(xiàn)了一部分免疫原性蛋白的，如gltA、ubiG、fabA、gap等，其中ubiG、BruAb1_1617、dadA為本研究中544A和16M的表達(dá)差異蛋白，猜測(cè)是可引發(fā)免疫應(yīng)答的毒力因子。優(yōu)選了5個(gè)蛋白基因進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增，在544A、16M和各自疫苗株S19、M5中均有這