親和組合分組系統(tǒng)的研究及在蛋白組學(xué)中應(yīng)用.pdf

1、細(xì)胞中含有成千上萬種不同分子量、相對(duì)豐度、酸堿性和疏水性分布范圍很寬的各種結(jié)構(gòu)或功能蛋白，用現(xiàn)有儀器手段分析如此復(fù)雜的生物樣品，就需要一個(gè)有效的方法分離、簡化復(fù)雜的組織蛋白樣品，提高質(zhì)譜對(duì)蛋白的檢出率。本論文開發(fā)了一套基于親和層析的組合分組系統(tǒng)對(duì)組織樣品進(jìn)行簡化分組，分組后分別進(jìn)行trypsin蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，分組后通過質(zhì)譜分析能夠鑒定出更多的蛋白信息。本論文開發(fā)出串聯(lián)親和與級(jí)聯(lián)親和兩種親和組合分組系統(tǒng)，并應(yīng)用于大鼠肝

2、細(xì)胞溶質(zhì)和小鼠睪丸蛋白組學(xué)研究中。
　　 將不同的氨基酸、小肽或氨基化合物連接到Sepharose固相基質(zhì)上構(gòu)建了本實(shí)驗(yàn)室小分子化學(xué)配體庫，這些親和配體的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致了不同的蛋白-配體非鍵相互作用，從而能夠特異親和吸附不同的蛋白組。分析不同親和配體的蛋白結(jié)合圖譜，找出蛋白條帶分布差異明顯、吸附性能適中的親和配體，如果這些差異親和配體的吸附蛋白圖譜的條帶疊加能夠覆蓋原始樣品電泳圖譜的全蛋白譜，就可以作為親和組合分組系統(tǒng)的備選配體。

3、本論文篩選到的主要差異親和配體為:A1-4、A6、A7-56、A8-54、A11-70、A15、A17-56、A25-35、A29-32和A84。
　　 大鼠肝細(xì)胞溶質(zhì)組織勻漿蛋白(Fraction0)通過A7-56、A84、A11-70、A6、A29-32五柱串聯(lián)親和組合系統(tǒng)分配后得到5個(gè)吸附組分(Fraction1～Fraction5)和1個(gè)流穿組分(Fraction6)。通過LC-MS/MS分析，F(xiàn)raction0中鑒定出

4、371個(gè)非冗余的可信蛋白組（1450個(gè)特異多肽），而6個(gè)串聯(lián)親和組分Fraction1～Fraction6中分別鑒定出289、123、152、279、154和60個(gè)非冗余的可信蛋白組。統(tǒng)計(jì)合并剔除重復(fù)部分后，6個(gè)串聯(lián)親和分配亞組分中總共鑒定得到665個(gè)非冗余的可信蛋白組(2413個(gè)特異多肽)，是串聯(lián)親和分組前蛋白鑒定數(shù)目的1.8倍。665個(gè)大鼠肝鑒定蛋白中，430個(gè)蛋白只出現(xiàn)在特異的某一組分中而不與其他組分重疊，比例高達(dá)64.7％，這充

5、分展示了串聯(lián)親和分組系統(tǒng)中各親和配體蛋白吸附特性的差異，通過這些差異配體的串聯(lián)組合實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜樣品的簡化分組。對(duì)鑒定蛋白的生物信息分析發(fā)現(xiàn)，串聯(lián)親和分組系統(tǒng)對(duì)各種極端特性蛋白都有較好的敏感性，665個(gè)鑒定蛋白中有61個(gè)極端尺寸蛋白(MW＜10kD，or＞100kD)，14個(gè)極端等電點(diǎn)蛋白(pI＜4.3，or＞10)，55個(gè)疏水蛋白（GRAVY正值）和41個(gè)膜蛋白。
　　 大鼠肝細(xì)胞溶質(zhì)組分(F0)通過A15～A8-54～A11-7

6、0三級(jí)聯(lián)親和分組系統(tǒng):第一級(jí)分配得到F1-1和F1-2兩個(gè)組分，第二級(jí)得到F2-1～F2-4四個(gè)組分，第三級(jí)得到F3-1～F3-8八個(gè)組分。LC-MS/MS分析，F(xiàn)0中鑒定得到391個(gè)非冗余的可信蛋白組，F(xiàn)1-1和F1-2中鑒定出499個(gè)蛋白組（提高27.6％），F(xiàn)2-1～F2-4中鑒定出616個(gè)蛋白組（相比第一級(jí)提高了23.4％），F(xiàn)3-1～F3-8中鑒定出738個(gè)蛋白組（相比第二級(jí)提高了19.8％）。大鼠肝細(xì)胞溶質(zhì)通過三級(jí)聯(lián)親和分組

7、系統(tǒng)總共鑒定出859個(gè)非冗余的可信蛋白組，是未分組前鑒定蛋白數(shù)目的2.2倍。鑒定的859個(gè)大鼠肝蛋白中，有75個(gè)分子量＜20kDa的蛋白，73個(gè)分子量＞100kDa蛋白，72個(gè)疏水蛋白和49個(gè)膜蛋白。
　　 以成熟的A15～A8-54～A11-70三級(jí)聯(lián)親和分組系統(tǒng)對(duì)小鼠睪丸蛋白組學(xué)進(jìn)行了研究，級(jí)聯(lián)親和分組后的8個(gè)組分中共鑒定得到1378個(gè)非冗余的可信蛋白組，是分組前鑒定蛋白數(shù)目的2.6倍，是文獻(xiàn)報(bào)道的2-DE-MS方法鑒定的最

8、大小鼠睪丸蛋白數(shù)目的2.7倍。1378個(gè)鑒定蛋白中，尺寸最小的是只有817Da的小肽，最大的高達(dá)630.35kDa,12個(gè)蛋白分子量＜10kDa,169個(gè)蛋白分子量＞100kDa,38個(gè)蛋白pI＜4.5,51個(gè)蛋白pI＞10，有93個(gè)疏水蛋白和81個(gè)膜蛋白，這都超出了現(xiàn)有小鼠睪丸蛋白組學(xué)研究中獲得極端特性蛋白的極限。我們還對(duì)所有鑒定蛋白的亞細(xì)胞器定位和蛋白功能定義進(jìn)行了歸類分析，其中有310個(gè)蛋白(22.5％)亞細(xì)胞器定位信息未知，22

9、1個(gè)蛋白在Uniprot數(shù)據(jù)庫沒有GO分子功能定義，分析找出了16個(gè)與生精及精子發(fā)育相關(guān)的蛋白。
　　 我們的研究結(jié)果表明:串聯(lián)和級(jí)聯(lián)兩種親和組合系統(tǒng)都能夠快速實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜組織樣品的預(yù)分組，分組后大大提高了質(zhì)譜分析的蛋白檢出率。親和組合分組系統(tǒng)相比2-DE和2D-LC分配方法具備無可比擬的優(yōu)越性:簡單快速（可以節(jié)省至少2/3時(shí)間），親和配體容易制備、穩(wěn)定性好（耐酸、堿和高壓處理），不需要特別高昂的設(shè)備，對(duì)不同組織樣品可以采用標(biāo)準(zhǔn)化