2蛋白組學(xué)-二維電泳1

1、蛋白質(zhì)組學(xué),浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院江 輝zhedajianghui@163.com密碼：shenghua,蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路和技術(shù),第二章 二維電泳與蛋白質(zhì)分離,一、蛋白質(zhì)的提取與樣品制備二、二維等電聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳三、膠上蛋白質(zhì)檢測技術(shù),一、蛋白質(zhì)的提取與樣品制備,從生物材料中獲得所需蛋白質(zhì)樣品的過程意義蛋白質(zhì)組分析的基礎(chǔ)，也是研究工作第一步制備的完整性、純度、濃度對下面分析非常重要無完全通用技

2、術(shù)（技術(shù)和大量經(jīng)驗的結(jié)合）包括分離、提取、純化（分開、結(jié)合、省略）分離：生物樣品提取液中的蛋白質(zhì)與其它大量雜質(zhì)分開提取：將已經(jīng)與其它物質(zhì)分開的蛋白質(zhì)提取出來（如沉淀等）純化：對提取的蛋白質(zhì)進一步清除雜質(zhì)成為純度高的蛋白質(zhì)樣品（如親和純化等）,二維電泳分析中的樣品制備（目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中的存在方式）,穩(wěn)定性（熱、pH、蛋白酶、化學(xué)試劑等）豐度定位（膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等）溶解性（可溶、微溶、難溶、不溶）分離難易程度制備變

3、性、活性蛋白,二維電泳分析中的樣品制備,制備原則：盡可能采用簡單方法進行樣品處理，以避免蛋白質(zhì)損失。（1）明確研究目標(biāo)，獲得盡可能多的感興趣蛋白。（2）不同類型的蛋白質(zhì)需要不同的方法（3）考慮目標(biāo)蛋白性質(zhì)，細(xì)胞破碎選擇溫和和激烈兩種方法應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品（特別是溶解性低的蛋白如膜蛋白）在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣

4、品降解（如酶性或化學(xué)性降解等）。防止發(fā)生化學(xué)修飾（加入尿素之后，加溫不要超過37°C，以防蛋白質(zhì)氨甲?；?。,破壞蛋白質(zhì)與其它大分子之間的相互作用，形成線性、獨立的肽鏈樣品裂解液新鮮制備，并且分裝凍存于-80°C，不要反復(fù)凍融樣品。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。通過超速離心清除所有的雜質(zhì)。主要去除鹽、小分子化合物、脂類、離子去污劑、核酸、多糖、脂類、酚類等盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而

5、保證待研究蛋白的可檢測性。,蛋白質(zhì)制備流程,分離、提取、純化分離：組織或細(xì)胞破碎最大程度的細(xì)胞破碎最小程度的蛋白水解或降解提?。悍蛛x或沉淀蛋白質(zhì)（可選擇）去除雜質(zhì)（除鹽、小分子化合物、脂類、離子去污劑、核酸、多糖、脂類、酚類等）冷凍干燥、沉淀（TCA、丙酮）等純化：去除無關(guān)雜質(zhì)（可選擇）反復(fù)提取分級提取,樣品類型,整體樣品：單細(xì)胞微生物、微生物混合菌等組織樣品：器官（肝臟）、植物組織（根、葉）等細(xì)胞（細(xì)胞器）樣品：

6、培養(yǎng)細(xì)胞、分離細(xì)胞、細(xì)胞核、線粒體等可溶性樣品：血清、尿液等,細(xì)胞裂解的方法,1、溫和裂解的方法:裂解對象主要是一些容易裂解的細(xì)胞，如組織培養(yǎng)細(xì)胞、血細(xì)胞和微生物等。同時溫和裂解方法可用于一些亞細(xì)胞分級產(chǎn)物，如線粒體、高爾基體和膜等。,2、劇烈的細(xì)胞裂解方法:破碎不容易破碎的細(xì)胞如固體組織中的細(xì)胞或有堅韌細(xì)胞壁的細(xì)胞,蛋白質(zhì)的分離與提取方法,硫酸銨沉淀高鹽溶液中，蛋白傾向聚集沉淀；但很多蛋白即使在高鹽中也可溶攪拌情況下，緩慢滴加(

7、NH4)2SO4到飽和，離心分離蛋白三氯乙酸沉淀10-20％即可沉淀蛋白；再溶解困難丙酮沉淀常用方法加入3倍以上體積丙酮，-20?C沉淀2h以上，離心分離蛋白三氯乙酸－丙酮沉淀同時加入三氯乙酸和丙酮， -20?C沉淀，離心分離蛋白；再溶解困難苯酚提取－甲醇中乙酸銨沉淀飽和酚提取蛋白，甲醇中用NH4Ac沉淀蛋白，依次用NH4Ac和丙酮洗滌沉淀,裂解液的組成,目的：加入裂解液主要是確保一向等電聚焦之前樣品的完全溶解和變性

8、組成：IPG緩沖液（IPG buffer）：Tris等離液劑（Chaotropic Agents） ：硫脲和尿素 去污劑（Detergents）： SDS、TritonX-100、NP-40、CHAPS等還原劑（Reducing Agents）：β-巰基乙醇、DTT或TDF （二硫赤蘚糖）和三丁基膦(TBP)等兩性電解質(zhì)（Carrier ampholytes）蛋白酶抑制劑（protease inhibitors）：PMSF等

9、,離液劑（Chaotropic Agents）,尿素是最常用的離液劑，2mol/L硫脲和5-8mol/L尿素聯(lián)合使用（硫脲在水中的溶解性很差）原理：NH2-CO-NH2, NH2-CS-NH2 改變或破壞氫鍵等次級鍵的結(jié)構(gòu)，使得蛋白質(zhì)變性并使蛋白酶失活破壞了疏水鍵（防止了聚集作用和二級結(jié)構(gòu)的形成，聚集作用和二級結(jié)構(gòu)的形成會改變蛋白質(zhì)的遷移性）硫脲和尿素聯(lián)合使用，可以大大增加蛋白質(zhì)的溶解性，特別是膜蛋白的溶解性 使用注意點：

10、 樣品離心前在室溫下至少保持1小時，使完全變性和溶解；樣品含尿素不可加熱，防蛋白修飾；樣品類型不同，選擇裂解液的組成也不同,去污劑（Detergents）,破壞蛋白質(zhì)分子之間的疏水相互作用，提高蛋白質(zhì)的溶解性，防止在等電聚焦時析出。 類型：離子型：SDS等非離子型：TritonX-100、NP-40等兼性離子型：CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propane s

11、ulfonate)、ASB-14(Amidosulfobetaine 14)等使用注意：原則上去污劑應(yīng)該是非離子型或者是兼性離子型，這樣才不會影響蛋白質(zhì)遷移到它們各自的等電點位置。離子型去污劑如SDS不利于等電聚焦。SDS的緩沖液可抑制蛋白質(zhì)被內(nèi)源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白質(zhì)的溶解性，特別是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于樣品處理的初級階段。 CHAPS比其他去污劑溶解疏水性氨基酸殘基的能力更好，然而在高濃度脲中的溶解度比較低

12、,還原劑（Reducing Agents）,斷裂蛋白質(zhì)分子中Cys殘基之間形成的二硫鍵，增加蛋白質(zhì)的溶解性。常用的還原劑有β-巰基乙醇、DTT或TDF （二硫赤蘚糖）和三丁基膦(TBP)等。DTT是使用比較廣泛的還原劑。50mmol/L時能有效地還原大部分的二硫鍵 使用注意點：DTT的pKa在8左右，如果過分提高DTT的濃度會影響到pH梯度。DTT在堿性pH值下會發(fā)生去質(zhì)子化，在等電聚焦時，向陽極發(fā)生遷移，使得陰極的DTT損耗

13、而不足。導(dǎo)致二硫鍵復(fù)原，蛋白質(zhì)沉淀。 非離子型還原劑TBP則比DTT更加有效，能大大增加蛋白質(zhì)的溶解性，在低摩爾濃度下就能使蛋白質(zhì)得以還原。,兩性電解質(zhì)（Carrier ampholytes）,防止蛋白質(zhì)過早沉淀在它們的等電點附近，促進蛋白質(zhì)的溶解。在第一向等電聚焦時，提高極性端蛋白質(zhì)的聚焦效果。吸附高濃度尿素在溶液中形成的氰酸鹽離子。離心時還有助于核酸的沉淀。阻止樣品蛋白質(zhì)和IPG 膠條中固相化的兩性電解質(zhì)相互作用。,兩性電解

14、質(zhì)對蛋白溶解性和2-DE分辨率的影響,蛋白酶抑制劑防止蛋白酶裂解,防止細(xì)胞裂解時蛋白酶釋放出來降解蛋白質(zhì)。低溫、pH>9的裂解液可降低蛋白酶活性，但不能真正消除，故得加酶抑制劑（以下一種或數(shù)種的混合物）（1）PMSF：苯甲磺酰氟，工作濃度1M，能不可逆滅活絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。（2）AEBSF：可在水溶液中使用，工作濃度4M，能不可逆滅活絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可能改變蛋白質(zhì)的等電點

15、。（3）EDTA、EGTA：乙二氨四乙酸和乙二醇雙四乙酸的工作濃度為1M，作用對象為金屬蛋白酶。,（4）肽蛋白酶抑制劑：價格貴，本身會出現(xiàn)二維電泳圖中。 亮抑酶肽：在DDT中可逆抑制絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。 胃蛋白酶抑制劑A：作用對象為天冬氨酸蛋白酶。 抑蛋白酶A肽：作用對象為絲氨酸蛋白酶。 苯丁抑制素：作用對象為氨基蛋白酶。（5）TLCK、TPCK：甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮、甲苯磺酰

16、苯氨酰氯甲酮的工作濃度為0.1-0.15mM，能不可逆滅活絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。,清除影響二維電泳圖譜的雜質(zhì),（1）鹽、殘留的緩沖液和電性小分子鹽等帶電物質(zhì)會干擾電泳過程、增大溶液電導(dǎo)率，通常用透析、凝膠過濾、沉淀/重懸的方法脫鹽，但易使樣品丟失。（2）內(nèi)源性小分子這些物質(zhì)通常帶負(fù)電，使陽極側(cè)的聚焦不全，可采用丙酮/TCA沉淀去除。（3）離子去污劑SDS等離子去污劑，易和多肽形成復(fù)合物而干擾IEF，-2

17、00C的丙酮溶液可除去。,（4）核酸核酸增加樣品黏度，導(dǎo)致二維電泳背景發(fā)散；能與蛋白質(zhì)結(jié)合，阻礙聚焦；銀染時出現(xiàn)高背景。加0.1V的核酸酶溶液(1mg/ml DNAase+0.25 mg/ml RNAase+50mM MgCl2)冰上孵育，但要注意核酸酶本身會出現(xiàn)在圖譜中。 （5）多糖多糖能阻礙凝膠孔徑、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物、延長聚焦時間、可能出現(xiàn)水平條紋，可用(NH4)2SO4或苯酚- NH4Ac沉淀后離心，或用超速離

18、心去多糖。（6）脂類脂類易和膜蛋白結(jié)合成復(fù)合物，改變蛋白溶解性、等電點和分子量，采用大量去污劑可除去。 （7）酚類通常出現(xiàn)在植物組織中，通過氧化反應(yīng)修飾蛋白質(zhì)，可加還原劑抑制氧化，也可用沉淀法去除，或加抑制劑滅活多酚氧化酶。,蛋白質(zhì)的分級提取,在2-DE膠中所能顯示出的蛋白質(zhì)的數(shù)量，依賴于細(xì)胞中蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)、蛋白質(zhì)的溶解性、蛋白質(zhì)的上樣量及電泳后染色方法的靈敏度。為了能夠富集低拷貝蛋白質(zhì)，采用了樣品預(yù)分級的方法，

19、如亞細(xì)胞分級、親和分級、蛋白質(zhì)復(fù)合物分級和根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性的順序提取法等。應(yīng)用雙向凝膠電泳分離手段，一步提取法一般只能獲得1000-2000個不同的蛋白質(zhì)點；而使用分級順序提取方法，對不同組分進行分離，據(jù)報道能夠獲得上萬個不同的蛋白質(zhì)點。主要分步提取策略：蛋白質(zhì)溶解度蛋白質(zhì)細(xì)胞定位蛋白質(zhì)親和力,分步提取法（溶解性差異）,1998年 Molley提出結(jié)合高效裂解液分步溶解的技術(shù)路線:1、水溶液提取，溶解親水性蛋白質(zhì)

20、5-15mg細(xì)胞+2ml裂解液I（40mM Tris）——反復(fù)凍融3-4循環(huán)——加適量DNase I和 RNase A——震蕩混均、離心收集上清（沉淀留下一步） 、冷凍干燥，得提取物I。2、含Urea/CHAPS/DTT溶液的提取，溶解親水性、中性和疏水性蛋白 第一步沉淀物+50μl 裂解液II——劇烈震蕩混均，離心收集上清（沉淀留下一步），得提取物II。裂解液II：8 M Urea (解聚劑)、4% CHAPS (表面活性劑

21、)、100mM DTT(還原劑)、 40mM Tris 、0.5% Pharmalyte3-10 、20 μg/ml DNase I 、 5 μg/ml RNase A,3、含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取，溶解疏水性蛋白 第二步沉淀物——40mM Tris清洗——200μl 裂解液III 溶解——劇烈震蕩混均，離心收集上清，保存于-70 ℃。裂解液III：5 M Urea 、 2 M Thiourea (解聚劑) 、2% C

22、HAPS 、 2%SB3-10 (表面活性劑) 、2mM TBP(還原劑)、 40mM Tris 、0.5% Pharmalyte3-10 、20 μg/ml DNase I 、 5 μg/ml RNase A 。對大部分細(xì)胞提取，第一步與第二步往往出現(xiàn)相同的圖譜，最后一步因膜蛋白提取出來而完全不同。若先將細(xì)胞器分級提取，再聯(lián)合上述方法，效果將更好。,ReadyPrep? Sequential Extraction Kit （B

23、ioRad公司）,亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)的提取,1、細(xì)胞中亞細(xì)胞器的分離 據(jù)亞細(xì)胞器的大小、形狀、密度的差異，利用差速離心和密度梯度離心進行分離。細(xì)胞破碎后，先低速離心從胞質(zhì)溶液中分離出細(xì)胞核和未破碎的細(xì)胞，得到上清溶液；隨后對上清溶液進行密度梯度分離，得到線粒體、溶酶體等亞細(xì)胞器；然后對亞細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進行分離提取。,差速離心,在密度均一的介質(zhì)中不同顆粒大小的物質(zhì)在不同的離心力作用下沉降而分離不同細(xì)胞器有不同的大小和沉降特性,不同細(xì)胞

24、器的大小和沉降特性,差速離心,差速離心形成的沉淀（肝臟）,密度梯度離心,用一定的介質(zhì)在離心管中形成連續(xù)或不連續(xù)的梯度，通過一定的離心力的作用使得細(xì)胞器進行分層分離。速度沉降：密度相近但大小不等等密度沉降平衡：密度不等的物質(zhì),1、速度沉降,生物顆粒在一定的密度梯度介質(zhì)中按照各自的沉降系數(shù)（S）以不同的速度沉降。必須在沉降最快的生物顆粒到達(dá)管底前停止沉降，并將各部分收集通常在密度較低的介質(zhì)中進行，一般不需要高速離心牛血清、Fico

25、ll（聚蔗糖）、白蛋白等,2、等密度沉降平衡,生物顆粒的在連續(xù)或不連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長時間沉降到與其自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在該處達(dá)到平衡，從而將不同密度的生物顆粒分離。介質(zhì)密度較高，介質(zhì)的最高密度大于分離組分的最大密度，密度具有一定的陡度離心力比較大，離心時間長Ficoll、Percoll（細(xì)胞分離液 ）、Metrizamide（甲泛葡胺 ）等,純化不同細(xì)胞器所推薦的梯度和離心條件,縮寫： (NUC)細(xì)胞

26、核； (PMS)大片細(xì)胞膜； (MTT)線粒體； (LYS)溶酶體； (PER)過氧化物酶體； (PMV)細(xì)胞膜小泡； (SER)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)； (RER)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)； (END)核內(nèi)體； (SARCRT)肌質(zhì)網(wǎng)； (NUCMB)核膜； (OUTER MITMB)線粒體外膜； (INNER MITMB)線粒體內(nèi)膜； (HOM)勻漿物； (dc)非連續(xù)； (c)連續(xù)。,特殊細(xì)胞器的提取,1、膜蛋白的提取（1）膜蛋白的定義：與膜相關(guān)的蛋白，

27、如脂雙分子層嵌入蛋白，也叫跨膜蛋白。膜蛋白占細(xì)胞總蛋白約30%，在細(xì)胞生命活動中起重要作用（如信號蛋白、黏附蛋白、載體蛋白），許多膜蛋白是藥物作用靶標(biāo)。,（2）膜蛋白提取注意點,A、膜蛋白的純度與膜粘連的細(xì)胞器可能部分分離出來造成假性，故用KBr溶液或用更多的離液劑進行清洗，可去掉與膜作用不強的非膜蛋白，從而富集膜蛋白。另外膜蛋白通常位于兩相去污系統(tǒng)中相對較豐富的一相。B、膜蛋白的特性低豐度、大多偏堿性、難溶于等電聚焦的水相

28、介質(zhì)中。C、為了從二維電泳凝膠圖譜中分離出膜蛋白，首先必須服從三個條件a、必須保證膜的脂類環(huán)境，同時要避免過多的脂對IEF的干擾。b 、必須以一種可溶的形式（通常是去污劑-蛋白復(fù)合物）從膜中分離出來。c、所提取的膜蛋白必須在等電聚焦過程中（特別在等電點附近）保持可溶狀態(tài)。新的去污劑、對疏水蛋白強溶解的裂解液使膜蛋白提取進一步完善，毫克級上樣量的二維電泳設(shè)備提高了分離的可靠性。,2、核蛋白的提取,（1）核基質(zhì)的提取

29、 A、核基質(zhì)定義：非染色體結(jié)構(gòu)蛋白及細(xì)胞核徑向高鹽離子、核酸酶、去污劑抽提所剩的核蛋白網(wǎng)上結(jié)構(gòu)，包括核纖維蛋白、低豐度核蛋白、核內(nèi)核糖核蛋白及DNA結(jié)合區(qū)。 B、提取步驟： 細(xì)胞核在含0.5% TritonＸ－100和1.2mM蛋白抑制劑的緩沖溶液中勻漿數(shù)分鐘—— 離心去脂類和可溶性蛋白—— 取沉淀,與提取液4℃反應(yīng)15min —— 離心除可溶性骨架蛋白——取沉淀在消化液內(nèi)室溫消化30min —— 離心得核基質(zhì)蛋白和中間絲

30、—— 再溶于含8M尿素的裂解液中—— 透析除尿素—— 離心得上清夜即為細(xì)胞核基質(zhì)蛋白。 提取液：100mM KCl+3mM MgCl2 + 0.5% TritonX-100+12mM PMSF 消化液：50mM NaCl+3mM MgCl2 + 100μg/ml DNase I+ 100μg/ml RNase A。,（2）核膜蛋白的提取,A、提取方法：核膜蛋白包括膜整合蛋白和多蛋白復(fù)合物，不能用去污劑提取，通常用分級制備法

31、得到：細(xì)胞核用冰TP緩沖溶液勻漿——4℃下攪拌90min、離心（1000×g） 30min —— 取沉淀用STM0.25 緩沖溶液重懸即得核膜蛋白提取液。 B、進一步分級提?。汉四さ鞍滋崛∫? TritonX-100 （終濃度0.5%）或 NaCl （終濃度1M ）或 Urea （終濃度4M）—— 4℃震蕩15min —— 13000rpm離心可得TX抗性蛋白及NaCl洗脫蛋白—— 50000rpm離心可得離液劑抗性

32、物質(zhì) C、常用溶液 TP緩沖溶液：10mM Tris-HCl pH7.4 + 10mM NaH2PO4 + 1mM PMSF+10 μg/ml aprotinin + 10μg/ml leupeptin + 250 μg/ml heparin+ 1mM Na3VO4 + 10mM NaF+400U Benzon uclease STM0.25 緩沖溶液: 20mM Tris-HCl pH7.4+0.25M

33、Sucrose+5mM MgSO4 + 1mM Na3VO4 + 1mM PMSF + μg/ml aprotinin + 10μg/ml leupeptin,第二章 二維電泳與蛋白質(zhì)分離,一、蛋白質(zhì)的提取與樣品制備二、二維等電聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳維等電聚焦電泳三、膠上蛋白質(zhì)檢測技術(shù),電泳的概念,帶電顆粒在一定的介質(zhì)中，在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。影響電泳速度的主要因素：電場強度（E）：E越高，

34、電泳速度越快溶液的pH值：pI和pH相差越多，帶電越多，電泳速度越快溶液的離子強度（I）：I越高，樣品電流越小，電泳速度越慢；I過低，可導(dǎo)致pH局部變化影響電泳速度電滲：介質(zhì)局部電離導(dǎo)致的樣品電泳速度改變焦耳熱（Q）：熱量高，促使溶液揮發(fā)；同時使得電流降低導(dǎo)致電泳速度減慢,生物實驗室常用電泳,支持物分類濾紙及纖維膜等：玻璃纖維、醋酸纖維等凝膠：瓊脂（agarose）、聚丙烯酰胺凝膠（PAG）等裝置分類平板式垂直板式圓

35、盤式pH連續(xù)性分類連續(xù)pH非連續(xù)pH：如等電聚焦電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）,聚丙烯酰胺凝膠（ polyacrylamide gel, PAG ）由單體丙烯酰胺（acrylamide，Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（ N，N’-methylenebisacrylamide, Bis）聚合而成。,,聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：,(1) 在一定濃

36、度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2) 化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；(3) 對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4) 幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5) 樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g(6) 凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7) 分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和

37、電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。,二維電泳的基本原理,據(jù)蛋白質(zhì)的兩個一級屬性等電點和相對分子量的特異性，將蛋白質(zhì)混合物在第一方向按等電點高低進行等電聚焦分離（IEF），在第二方向按照分子量大小進行SDS-PAGE分離（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）1st dimension: Isoelectric focusing (charge)2nd dimension: SDS-PAGE (size

38、),二維電泳結(jié)果,二維電泳分離后的蛋白質(zhì)經(jīng)染色（考馬氏亮藍(lán)染、銀染、負(fù)染、熒光染色、放射標(biāo)記染色）、通過圖象標(biāo)志掃描存檔，最后顯現(xiàn)的是二維排列的“滿天星”，每個星點代表一個蛋白質(zhì)。最終獲得蛋白質(zhì)相對分子量、等電點和相對豐度三方面的數(shù)據(jù)。傳統(tǒng)的二維電泳最好條件下20cm × 20cm的膠理論上可分辨10,000個蛋白點（各個方向100點），實際上只能3000個點.二維電泳得到的實驗結(jié)果并非功能蛋白，事實上由于樣品處理過程中涉

39、及亞基間的二硫鍵還原和烷基化處理，即蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)已被消除，最終得到的是蛋白質(zhì)的亞基。,一維等電聚焦（IEF）,蛋白質(zhì)等電點pI是由其內(nèi)氨基酸組成決定的特性物化常數(shù)。當(dāng)介質(zhì)pH高于其等電位置時，蛋白質(zhì)帶負(fù)電，反之帶正電；此時外加一個電場，蛋白質(zhì)分子就分別向正極或負(fù)極移動，當(dāng)達(dá)到其等電點位置時，蛋白質(zhì)不帶電就不再漂移。這樣，蛋白質(zhì)組內(nèi)的蛋白質(zhì)按照pI不同分布在膠上不同位置，這就是等電聚焦基本原理。,等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點時，凈

40、電荷為零，在電場中不再移動。,等電聚焦電泳主要分為二種,載體兩性電解質(zhì)SCA （一種人工合成的兩性分子，Synthetic carrier ampholyte）：等電聚焦在聚丙烯酰胺管膠(Tube gel)中進行，載體兩性電解質(zhì) (Carrier Ampholytes)在外加電場作用下形成pH梯度。 （分辨率：0.01 pH單位）pH梯度在堿性區(qū)不穩(wěn)定(陰極漂移)、重復(fù)性不易掌握、上樣量低和一般不能分離等電點大于8.0的堿性蛋白質(zhì)電

41、泳設(shè)備要求不高，電泳溶液容易配制，易于開展工作。優(yōu)化各種電泳條件，可達(dá)到非常高的分辨率，目前唯一分辨到10000個蛋白質(zhì)，也可獲得好的重復(fù)性 固相pH梯度：pH梯度的形成依賴于不同pK值的Immobilines。 Immobilines是丙烯酰胺的衍生物，為非兩性的弱酸和弱堿，在凝膠聚合過程中，能與聚丙烯酰胺共價結(jié)合。因此，IPG膠的pH梯度是穩(wěn)定的 (Immobilized pH gradients，IPG) ，不依賴于外加電場，

42、基本上克服了載體兩性電解質(zhì)pH梯度的主要缺點。 （分辨率：0.001 pH單位）,載體兩性電解質(zhì)的特性,足夠高的緩沖能力，pH梯度不致被蛋白改變在等電點有足夠高的電導(dǎo)，有一定的電流通過分子量小化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，惰性,載體兩性電解質(zhì)pH梯度的形成,人工pH梯度法：利用兩種不同pH的緩沖液相互擴散，在混合區(qū)形成pH梯度天然pH梯度法：多種載體兩性電解質(zhì)在電場作用下自然形成pH梯度。常用。沒有電場作用下，溶液pH是溶液pH范圍的平均值

43、通電后，載體兩性電解質(zhì)向兩極移動pI最?。◣ё疃嘭?fù)電），向正極移動最快，在pH＝pI處停下來，并最接近陽極pI最大（帶最多正電），向負(fù)極移動最快，在pH＝pI處停下來，并最接近陰極,載體兩性電解質(zhì)分離蛋白質(zhì)原理,通電后，載體兩性電解質(zhì)可在支持介質(zhì)中形成線性pH梯度加入蛋白質(zhì)樣品，蛋白質(zhì)即按照等電聚焦的原理進行分離，蛋白質(zhì)都位于與其等電點pI相當(dāng)?shù)膒H位置上。,載體兩性電解質(zhì)的缺點,早期的凝膠介質(zhì)用的是載體兩性電解質(zhì)SCA （一種人

44、工合成的兩性分子，Synthetic carrier ampholyte），在電場中它們形成連續(xù)的pH梯度，且其有很高的緩沖能力。但存在許多缺點： A、SCA的合成方法太復(fù)雜，導(dǎo)致產(chǎn)品穩(wěn)定性較差，實驗重復(fù)性不好。 B、SCA分子量較小，在IEF過程中由水合正離子引起的電滲流將使SCA向負(fù)極漂移，造成pH不穩(wěn)定。 C、負(fù)極漂移造成的堿性區(qū)蛋白質(zhì)難以成功聚焦，導(dǎo)致堿性蛋白質(zhì)丟失。,固相pH梯度等電聚焦電泳,IPG（固

45、相pH梯度，Immobilized pH gradient）等電聚焦電泳（IEF）是在Immobilines試劑的基礎(chǔ)上開發(fā)的技術(shù)。利用一系列弱酸弱堿丙烯酰胺衍生物滴定時，在滴定點附近形成pH梯度，然后共價結(jié)合在介質(zhì)（丙烯酰胺）上，成為凝膠一部分，從而形成固定pH梯度。優(yōu)點：分辨率高（0.001 pH單位），重復(fù)性好，pH梯度穩(wěn)定，上樣量更高。,一維固相pH梯度等電凝膠,IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-

46、CO-NH-R結(jié)構(gòu)的多種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團。每種衍生物的pI值不同，不同比例的混合物構(gòu)成了分布在pH3－10不同值的緩沖體系。根據(jù)配方計算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團通過乙烯鍵共價聚合至丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的IPG不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進行特別穩(wěn)定的IEF分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。,IPG膠條的重泡漲,商品化的膠條是以干膠條的形式和塑料支撐

47、薄膜粘在一起，加樣前需要先撕去薄膜在重泡漲液中泡漲。 泡漲的實質(zhì)：讓樣品能完全以可溶的形式進入IPG內(nèi)，從而能進行接下來的IEF電泳。重泡漲液的成分為8 mol/L Urea, 2%CHAPS, 18mmol/L DTT, 0.5%IPG Buffer, Bromophenol Blue Trace，和裂解液基本相同 窄pH范圍的膠條，如pH9-12或pH10-12 ，重泡漲液的成分要根據(jù)樣品做適當(dāng)修改核糖體蛋白，重泡漲液的成分

48、為8 mol/L Urea, 10% v/v 2-propanol, 10% v/v Glycerol, 1% w/v CHAPS, 20 mmol/L DTT, 0.5% Pharmalyte 3-10, 0.2% w/v Methycellulose,重泡漲中參數(shù)的選擇,加樣方法的選擇（重泡漲上樣、杯上樣）重泡漲可以在等電聚焦盤內(nèi)進行，此時樣品加到重泡漲液中，在重泡漲過程中進入膠條在加樣杯上樣(cup-loading)方式中，膠

49、條在專門的重泡漲盤內(nèi)泡漲完成后再轉(zhuǎn)入等電聚焦盤內(nèi)加樣。 DTT的使用：10 mmol/L到100 mmol/L濃度范圍內(nèi)適當(dāng)提高DTT的濃度可提高蛋白質(zhì)的檢測靈敏度 重泡漲時間至少要10小時，泡漲不充分會影響相對分子質(zhì)量較高的蛋白質(zhì)的吸收 重泡漲液的體積和膠條的長度相匹配，一般參照產(chǎn)品說明書溫度的選擇：溫度都穩(wěn)定在20℃，溫度太低尿素會結(jié)晶出來，溫度不穩(wěn)定也會造成膠上蛋白質(zhì)點位置的變化 電壓的選擇：重泡漲時加上30V或50V的

50、低壓會促進膠條對蛋白質(zhì)的吸收,蛋白質(zhì)加樣方式,膠內(nèi)重泡漲(In-gel Rehydration) ：樣品在重泡漲時加入 。樣品加到重泡漲液中，在重泡漲過程中進入膠條推薦的方式，可以增加蛋白質(zhì)上樣量，也避免了在陰極或陽極加樣的方向問題 加樣杯加樣(Cup-Loading)：重泡漲完成后再轉(zhuǎn)入等電聚焦盤內(nèi)用專用的加樣杯加樣重泡后加樣相對不十分可靠，操作比較困難而且蛋白質(zhì)容易在膠和樣品的界面產(chǎn)生沉淀 某些特殊情況下，如使用pH6-1

51、1或pH6-9的膠條分離堿性蛋白質(zhì)時，在陽極用加樣杯加樣，可以得到更好的分離圖譜 紙橋加樣(Paper Bridge Loading) ：膠條重泡漲好以后，用1.5×5.0 cm的濾紙做為紙橋覆蓋在膠條的一端，將樣品加到濾紙上 可顯著提高蛋白質(zhì)的上樣量，并在分辨率和相對分子質(zhì)量較高的蛋白質(zhì)的分離方面有所改善,水化上樣,膠條面朝下覆蓋在樣品緩沖液上，電極位于膠面兩端可以主動水化、被動水化，選擇靈活水化、上樣同時進行操

52、作簡便，重復(fù)性好，適于分析型實驗對極酸/極堿性蛋白聚焦效果不夠好,杯上樣,水化完成后使用加樣杯在膠條上方上樣電極間距可調(diào)，一個聚焦盤可放入不同長度的膠條對酸/堿性蛋白分離效果較好上樣量較大，適于制備型實驗結(jié)果重復(fù)性不如水化上樣,等電聚焦設(shè)備,GE公司IPGphor 水平電泳系統(tǒng),Bio-Rad公司的Protean IEF System水平電泳系統(tǒng),影響蛋白載樣量的因素,影響IPG膠條蛋白載樣量的因素包括：待分析的蛋白點的量應(yīng)

53、滿足后續(xù)的質(zhì)譜分析電泳的目的：如果僅僅是為了得到一張好圖，則無需考慮太多其它因素。待研究蛋白的豐度樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能了解包含的蛋白，需要反復(fù)實驗才能完成。如果待測樣品富集以后則更易分析IPG膠條的pH范圍：pH范圍越窄，上樣量越大,IPG膠條的上樣量,IPG IEF 中pH梯度的選擇,常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗確定。,聚焦時間的優(yōu)化,理論上講，獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需的最佳

54、時間是IEF分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。聚焦時間太短，會導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會因為活性水轉(zhuǎn)運而導(dǎo)致過多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗來確定。,等電聚焦過程,等電聚焦的電壓上升分為三個階段：首先加上一個比較低的電壓，去除膠條中的過多的鹽離子。然后開始加高壓，電壓上升

55、的模式為緩慢上升。最后是持續(xù)高壓，電壓上升的模式為快速上升。第一向等電聚焦儀Protean IEF（ Bio-Rad ）最多可加到10000V的高壓 IPGphor（GE Healthcare）的最高電壓為8000V 一般原則是，根據(jù)膠條的pH范圍和上樣量的多少，總電壓時間積可以在一定范圍內(nèi)調(diào)整。 上樣量大、pH范圍窄則總電壓時間積高 Bio-Rad公司膠條總的電壓時間積為7cm 8～35 kVH, 11cm 15～60 k

56、VH, 17cm 25～100 kVH,等電聚焦條件,Protean IEF的聚焦設(shè)置和結(jié)果,pH 4 7,兩維間的平衡,一維結(jié)束后可馬上進行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－80°保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS-PAGE時電泳能順利進行。,平衡條件的選擇,平衡液：用含2%(m/v

57、)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺（IAA）取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。尿素和甘油可增加溶液粘度，減少電內(nèi)滲。電內(nèi)滲作用是由固相化的兩性電解質(zhì)造成的，它影響蛋白質(zhì)從第一向到第二向的轉(zhuǎn)移SDS用于變性蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷，這對第二向SDS-PAGE來講是十分重要的 DTT和IAA分別用于打開和烷基化封閉蛋白質(zhì)的二

58、硫鍵 溴酚藍(lán)用來檢測電泳過程 兩次平衡的時間均為15分鐘，如果圖譜的豎直條紋較多平衡時間可適當(dāng)延長到20分鐘，時間太短蛋白質(zhì)沒有被SDS充分包裹，容易產(chǎn)生水平條紋。,第一向到第二向的轉(zhuǎn)移,3T%的IPG膠條可以看作為壓縮膠，所以一般只使用分離膠，但也有人用壓縮膠。 IPG膠條平衡好后，一般將膠條在電泳緩沖液里浸潤一下可以清洗膠條，去除膠條上的平衡液潤濕的膠條容易沿著玻璃板推到SDS-PAGE凝膠上 IPG膠條轉(zhuǎn)移到SDS-

59、PAGE膠有兩種方式先將IPG膠條放到SDS-PAGE膠上，再加入熔化的瓊脂糖溶液。圖譜不易變形，但在兩塊膠之間容易有小氣泡產(chǎn)生。相比之下，氣泡對圖譜的影響較小，故為推薦方式 先加入熔化的瓊脂糖溶液，再將IPG膠條放到SDS-PAGE膠上。非常好地解決了膠之間的氣泡問題，但瓊脂糖容易凝固，插入IPG膠條時有時會造成圖譜變形。,聚丙烯酰胺凝膠（poly-acrylamide gel,PAG）,聚丙烯酰胺凝膠（ polyacrylam

60、ide gel, PAG ）由單體丙烯酰胺（acrylamide，Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（ N，N’-methylenebisacrylamide, Bis）聚合而成。,,根據(jù)不同的分離目的，按不同濃度比例來配制PAG膠:,a、丙烯酰胺 CH2=CH-CO-NH2b、N,N’-甲叉丙烯酰胺 CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2T、2個單體的總百分濃度C、 N,N’-甲叉丙烯酰胺占兩個單體總質(zhì)

61、量的百分比m、凝膠聚合前的溶液體積 T=(a+b)/m ×100%, C=b/(a+b) ×100%(1)T值一般在5%-30%之間，T太大粘度增加，T太小凝膠脆性太大溶液破裂。預(yù)實驗取13%,然后根據(jù)蛋白質(zhì)分子量調(diào)整T值。(2)C值一般在3%左右，而取2.6%更易于分離。,第二向分離：SDS－PAGE原理,SDS-PAGE：十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS：變性劑和助溶劑DTT，?-

62、巰基乙醇：還原劑SDS是一種陰離子去垢劑，溶液中SDS達(dá)一定濃度濃度時，可以和蛋白質(zhì)結(jié)合，使得蛋白質(zhì)負(fù)電荷過剩，掩蓋了蛋白質(zhì)本身的電荷。蛋白質(zhì)的形狀與蛋白質(zhì)的分子量成比例。在電場作用下，各個蛋白質(zhì)的形狀決定蛋白質(zhì)的遷移率，也就實現(xiàn)了按照分子量大小進行分離。蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對數(shù)有線性關(guān)系。,垂直電泳設(shè)備,GE公司Hoefer SE垂直電泳系統(tǒng),Bio-Rad公司PROTEAN II XL Cell垂直電泳系統(tǒng),二維SDS-