基于二維液相色譜技術(shù)的元胡活性成分篩選及其藥效和毒性機(jī)制的蛋白組學(xué)研究.pdf

1、“中藥研究中最困難的，也是最重要的一點(diǎn)，就是找出它的有效成分，然后進(jìn)行作用機(jī)制研究，并將其推薦于臨床應(yīng)用，或進(jìn)一步進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究，以求新的發(fā)展?！保愐藦堄凇吨兴幯雍餮芯恐械男掳l(fā)現(xiàn)》序三）。盡管中藥的應(yīng)用歷史可以追溯幾千年，但是中藥發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)是什么?其作用的靶點(diǎn)是什么?作用機(jī)制是什么?這些問題一直未被世人所徹底揭示。近年來，隨著中藥不良反應(yīng)的增加，許多傳統(tǒng)認(rèn)為沒有毒性的中藥也出現(xiàn)不良反應(yīng)，對(duì)中藥不良反應(yīng)的認(rèn)識(shí)，不能再局限于傳

2、統(tǒng)文獻(xiàn)記載的那些有毒中藥上，必須利用現(xiàn)代科技開展藥物安全性評(píng)價(jià)工作并對(duì)中藥的毒理機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究。另外，如何在中醫(yī)藥基本理論的指導(dǎo)下，結(jié)合現(xiàn)代科研手段，在細(xì)胞和分子水平明確中藥的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制，也是目前中藥研究亟需解決的問題。
　　 系統(tǒng)生物學(xué)是研究一個(gè)生物系統(tǒng)中所有組成成分（基因、mRNA、蛋白質(zhì)、代謝物等）的構(gòu)成，以及在特定條件下這些組分間相互關(guān)系的學(xué)科。系統(tǒng)生物學(xué)的研究方法與中醫(yī)治療疾病的整體觀念是一致的。蛋白組學(xué)是系

3、統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。蛋白組學(xué)認(rèn)為中藥有效部位或有效成分進(jìn)入細(xì)胞或組織發(fā)揮作用，必然會(huì)引起分子、細(xì)胞、器官、整體多個(gè)層面的結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)的改變。蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)功能的執(zhí)行者，生物體結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)的改變必然在蛋白組水平上表現(xiàn)出來。因此，蛋白組學(xué)以蛋白質(zhì)的豐度或翻譯后修飾為指標(biāo)，對(duì)中藥活性成分的作用靶點(diǎn)和效應(yīng)蛋白進(jìn)行識(shí)別，建立起相應(yīng)的作用網(wǎng)絡(luò)，探討其藥理、毒副作用機(jī)制?；瘜W(xué)蛋白組學(xué)主要用于研究在復(fù)雜蛋白質(zhì)體系中，能與活性小分子相互作用的蛋

4、白組。通過對(duì)該活性小分子進(jìn)行標(biāo)記或固定化，可以實(shí)現(xiàn)與其相互作用的蛋白組的選擇性富集和鑒定。與傳統(tǒng)的差異蛋白組學(xué)技術(shù)相比，只有與被標(biāo)記或固定化小分子相互作用的蛋白質(zhì)才能夠被富集并檢測(cè)，因而可以大大降低特定蛋白組的復(fù)雜度，從而提高對(duì)中、低豐度蛋白的檢測(cè)能力。此外，通過質(zhì)譜鑒定可以獲得關(guān)于活性小分子靶蛋白的信息，并進(jìn)一步闡述該分子的可能作用機(jī)理。
　　 本課題以傳統(tǒng)中藥元胡為研究對(duì)象，以二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜為檢測(cè)手段，借助血清藥理學(xué)

5、的研究理念，篩選中藥元胡的活性鎮(zhèn)痛成分；基于二維液相的篩選結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)左旋延胡索乙素（l-THP）是元胡的主要鎮(zhèn)痛活性成分之一，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。首先，我們應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合微透析取樣方法研究l-THP在大鼠紋狀體的藥代動(dòng)力學(xué)；針對(duì)l-THP臨床應(yīng)用中出現(xiàn)的肝臟毒副作用，本文應(yīng)用2D-nano-LC-MS/MS技術(shù)，研究其肝臟毒性的分子機(jī)制；l-THP能明顯抑制福爾馬林誘導(dǎo)的疼痛行為，本文聯(lián)用差異蛋白組學(xué)和

6、化學(xué)蛋白組學(xué)技術(shù)，研究l-THP的作用靶點(diǎn)和鎮(zhèn)痛機(jī)制，具體內(nèi)容包括：
　　 1.本文首先建立了福爾馬林鎮(zhèn)痛模型以評(píng)價(jià)元胡總生物堿（TAC）的鎮(zhèn)痛效果，發(fā)現(xiàn)灌胃給藥元胡總生物堿150 mg/kg后能夠有效抑制福爾馬林誘導(dǎo)的疼痛行為。接下來我們利用HSA生物色譜柱和ODS整體柱建立全二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，通過比對(duì)元胡總生物堿、元胡總生物堿入血和入紋狀體成分之間的差異，初步篩選元胡生物堿的鎮(zhèn)痛活性成分。在系統(tǒng)優(yōu)化全二維液相色譜串

7、聯(lián)質(zhì)譜法條件后，我們將其應(yīng)用于TAC的原成分、入血成分及入紋狀體成分的分析。在原成分分析時(shí)，我們共檢測(cè)到100多個(gè)化學(xué)成分，并對(duì)其中13種成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定；們共檢測(cè)到40余種入血成分并鑒定了其中7種主要成分，分別是原阿片堿、海罌粟堿、四氫巴馬亭、紫堇堿、小檗堿、四氫小檗堿和藍(lán)堇辛；在進(jìn)入紋狀體的約20種化合物中，4種原形化合物（原阿片堿、海罌粟堿、四氫巴馬亭、紫堇堿）的濃度較高。通過文獻(xiàn)查閱，我們發(fā)現(xiàn)這4種化學(xué)物具有潛在的鎮(zhèn)痛作用。盡管

8、對(duì)元胡總生物堿的鎮(zhèn)痛機(jī)制研究還存在很多不確定的因素，需要進(jìn)一步探討和驗(yàn)證，但是我們推測(cè)TAC的鎮(zhèn)痛作用與原阿片堿、海罌粟堿、四氫巴馬亭、紫堇堿的協(xié)同作用有關(guān)。本文的研究結(jié)果顯示全二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是中藥活性成分篩選的有效工具，能為中藥的作用機(jī)制研究提供有效的信息。
　　 2.L-THP是元胡的主要活性成分之一，具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，作為鎮(zhèn)痛藥在臨床上已應(yīng)用多年。L-THP是多巴胺受體的阻滯劑，通過阻滯紋狀體的D2多巴胺受體，

9、抑制痛覺信息在脊髓水平的傳遞，實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用。本研究首先建立了大鼠腦部紋狀體的微透析取樣模型，通過反透析法測(cè)定l-THP在紋狀體內(nèi)的回收率，并考察了l-THP濃度、取樣時(shí)間對(duì)體內(nèi)回收率的影響，發(fā)現(xiàn)微透析采樣技術(shù)能夠用于l-THP在腦部紋狀體組織的藥代動(dòng)力學(xué)研究。另外，我們建立了高通量、高靈敏度的LC-MS/MS分析方法，并進(jìn)行了完整的方法學(xué)驗(yàn)證。本文的研究證實(shí)微透析技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS分析方法，能夠成功的用于l-THP在紋狀體的藥代動(dòng)

10、力學(xué)研究。
　　 3.L-THP是臨床上應(yīng)用多年的鎮(zhèn)痛藥，但是近年來，l-THP在臨床應(yīng)用中出現(xiàn)了嚴(yán)重的肝臟副作用。在本文中，我們發(fā)現(xiàn)l-THP能夠誘導(dǎo)BALB/c小鼠肝細(xì)胞和human liver L-02細(xì)胞凋亡。通過Western Blots實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)一些凋亡指標(biāo)性蛋白（easpase-3、Bcl-2、Bax）的表達(dá)發(fā)生了顯著變化。我們以human liver L-02（L-02）細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用基于2D-nano

11、-LC-MS/MS的高通量蛋白組學(xué)研究技術(shù)，研究L-02細(xì)胞在毒性劑量的l-THP處理后，在蛋白表達(dá)層次上呈現(xiàn)的差異，從而探索l-THP致肝損傷可能的信號(hào)途徑。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過l-THP處理后，L-02細(xì)胞共有156個(gè)蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)明顯差異。這些蛋白涵蓋了復(fù)雜的功能領(lǐng)域，包括能量代謝、細(xì)胞骨架、核酸代謝和細(xì)胞凋亡等。我們選取了跟凋亡相關(guān)的蛋白進(jìn)行功能探討，并且選取兩個(gè)重要蛋白（mTOR and MEK2），對(duì)其含量表達(dá)進(jìn)行Western B

12、lots驗(yàn)證。最后我們發(fā)現(xiàn)，l-THP主要通過改變凋亡途徑中發(fā)揮重要作用的一些蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。并且從本實(shí)驗(yàn)可以看出，基于納升級(jí)二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的蛋白組學(xué)是研究藥源性肝毒性機(jī)制的有效手段。
　　 4.L-THP能明顯抑制福爾馬林誘導(dǎo)的疼痛行為，本文聯(lián)用差異蛋白組學(xué)和化學(xué)蛋白組學(xué)技術(shù)，研究l-THP的作用靶點(diǎn)和鎮(zhèn)痛機(jī)制。口服40 mg/kg的l-THP能夠顯著抑制福爾馬林產(chǎn)生的疼痛行為。基于文獻(xiàn)報(bào)道，紋狀體是l-

13、THP的主要鎮(zhèn)痛部位。我們以紋狀體蛋白組為研究對(duì)象，應(yīng)用基于2D-nano-LC-MS/MS的高通量蛋白組學(xué)研究技術(shù)，研究福爾馬林致痛大鼠在l-THP處理后，其紋狀體蛋白組的表達(dá)差異。我們?cè)O(shè)定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)鑒定到的上千種蛋白進(jìn)行篩選。最終我們選取得到17種具有顯著表達(dá)差異的蛋白。我們通過對(duì)隨機(jī)抽取的兩種蛋白（Neurabin-1和Calcium-dependent secretion activator1）的含量進(jìn)行WesternBl

14、ots驗(yàn)證，驗(yàn)證蛋白組學(xué)結(jié)果的可靠性，發(fā)現(xiàn)Western Blots實(shí)驗(yàn)結(jié)果能與蛋白組學(xué)結(jié)果較好吻合。另外，我們合成了基于l-THP的分子探針，通過化學(xué)蛋白組學(xué)技術(shù)，研究能與l-THP相互作用的蛋白組。我們發(fā)現(xiàn)差異蛋白組學(xué)和化學(xué)蛋白組學(xué)的結(jié)果能夠較好互補(bǔ)的。綜合化學(xué)蛋白組學(xué)和差異蛋白組學(xué)的研究結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)與離子通道，神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及信號(hào)傳導(dǎo)途徑等相關(guān)蛋白在l-THP的鎮(zhèn)痛機(jī)制中發(fā)揮重要作用。并且，聯(lián)用差異蛋白組學(xué)和化學(xué)蛋白組學(xué)技術(shù)能夠