二維色譜-質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)中的研究和應(yīng)用.pdf

1、該論文以二維色譜-質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ),優(yōu)化蛋白的提取、酶解、前處理以及后繼的二維分離條件和步驟,以求在該實(shí)驗(yàn)室建立一個(gè)適用于復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物分離分析的高通量平臺(tái).該論文的工作主要是圍繞二維-色譜-質(zhì)譜技術(shù)來展開的.考慮到酶解步驟在Shotgun技術(shù)中的重要性,首先利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白來考察各種蛋白變性方法對(duì)酶活性以及蛋白去折疊的影響,同時(shí)也討論了蛋白還原烷基化的必要性和有效性.并且考察了新型去垢劑ALS在蛋白酶解中的應(yīng)用,與SDS相比,它具有很好的

2、溶解能力,對(duì)酶活性的影響遠(yuǎn)比SDS小,它在酸性條件下可以自動(dòng)降解,降解物質(zhì)不會(huì)影響后繼的色譜分離,可以替代SDS來溶解膜蛋白.根據(jù)溶液酶解的特點(diǎn),結(jié)合現(xiàn)有的順序提取蛋白的方法,對(duì)用二維色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)分離鑒定的蛋白提取方法作了如下改進(jìn):將提取步驟分為三步,第一步用水提取偏親水性蛋白,第二步用含尿素和硫脲的溶液提取親水性、中性和偏疏水性蛋白,第三步用去垢劑ALS代替SDS溶解剩余的不溶物質(zhì).第二部分主要是二維色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)的建立及應(yīng)用.首先

3、對(duì)強(qiáng)陽離子交換色譜的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,比較了流動(dòng)相的pH值、有機(jī)溶劑的含量等因素對(duì)色譜分離的影響.根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的結(jié)果,以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的儀器裝置為基礎(chǔ),建立了離線二維系統(tǒng)和在線二維系統(tǒng).通過肌紅蛋白的酶解肽段的分離鑒定,對(duì)離線二維系統(tǒng)中的反相上樣時(shí)的傳輸溶液、組分收集時(shí)間以及在線系統(tǒng)中的進(jìn)樣鹽濃度等一些參數(shù)進(jìn)行了討論.并且比較了在線和離線系統(tǒng),離線系統(tǒng)靈活性比較強(qiáng),可以分別優(yōu)化每一維的實(shí)驗(yàn)條件,上樣量不受第二維反相色譜的制約,能夠富集低

4、豐度肽段;在線系統(tǒng)整合性比較強(qiáng),適合于少量樣品的分離鑒定,而且對(duì)控制SCX柱的色譜儀損害比較小.最后,利用離線二維系統(tǒng)分離D20裸鼠肝腫瘤組織的水溶性蛋白,鑒定得到101個(gè)蛋白組分,在大分子范圍(相對(duì)分子量>200,000 Da)及堿性范圍(pI>10)內(nèi)均有蛋白被檢出,蛋白數(shù)量也明顯多于用2D-PAGE-MS技術(shù)鑒定出來的蛋白個(gè)數(shù).另外,利用去垢劑ALS溶解紅細(xì)胞膜蛋白,用在線二維系統(tǒng)分離鑒定出大量的膜蛋白,彌補(bǔ)了常規(guī)的二維凝膠-質(zhì)譜