蛋白質組學中的多維液相色譜—質譜技術研究及其在胰腺癌標志物篩選中的應用.pdf

1、蛋白質組學是生命科學中繼基因組計劃之后最為活躍的熱點研究領域，蛋白質組學研究的關鍵在于蛋白質的分離和鑒定。二維凝膠電泳是目前應用最為廣泛的蛋白質組學分離技術，但其存在著諸多難以克服的缺陷；多維液相色譜以其分離效率高、方法靈活多樣，且容易實現自動化的特點，受到越來越多的研究者的重視，在蛋白質組學研究中逐漸擴大了應用范圍。本研究利用離線多維液相色譜聯用，對人血清和組織蛋白質進行了分離并用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-ass

2、istedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MADLI-TOFMS)進行檢測鑒定；將其應用于胰腺癌腫瘤標志物的篩選研究中，取得了比較滿意的效果。 本論文主要包括以下五個部分： 1.前言部分。簡述了蛋白質組學及其研究中的分離、生物質譜鑒定技術、生物信息學以及差異蛋白質組學研究等內容；介紹了胰腺癌的研究進展以及本研究的主要內容和意義。

3、2.體積排阻—反相色譜—質譜(SEC-RPLC-MS)對血清蛋白質組的研究。首先將血清樣品使用緩沖溶液稀釋、脲溶液變性和疏水色譜餅預分離三種方式進行預處理，并對預處理的條件作了優(yōu)化和比較。預處理后的樣品通過體積排阻(sizeexclusionchromatography,SEC)和反相色譜(reversephasechromatography,RPLC)離線聯用分離后，使用MADLI-TOFMS對各個組分進行檢測。結果表明選擇濃度為5.

4、0mol·L-1的脲溶液進行變性，有效降低了血清中高豐度蛋白對低豐度蛋白的影響。采用疏水色譜餅對血清進行預分離，提高了樣品處理量，有利于低豐度蛋白的富集和分離。同時研究中以肌紅蛋白為模型使用質譜對其結構進行了鑒定，方法穩(wěn)定，結果準確。 3.親合色譜—反相色譜—質譜(AFC-RPLC-MS)對血清糖蛋白質組學的研究。建立了使用AFC-RPLC分離和質譜檢測研究人血清中糖蛋白質組學的技術平臺。通過兩種不同方法對硅膠進行化學改性后，

5、鍵合伴刀豆球蛋白(concanavalinA，ConA)，制備了親合色譜柱。使用該親合色譜(affinitychoromatography，AFC)柱對標準糖蛋白RNaseB進行了分離純化，并對分離條件作了優(yōu)化。用糖肽酶PNGaseF和胰蛋白酶對RNaseB進行酶切后，再使用ConA親合柱分離出糖肽和多糖，結合使用質譜源后衰變技術，對糖蛋白的糖含量、糖蛋白的氨基酸序列、糖基化位點及糖連接方式作了研究。利用親合色譜對血清中的糖蛋白和酶解后

6、的糖肽進行了分離，結果表明該方法可用于血清中N-連接甘露糖型糖蛋白研究，并可以推廣用于糖蛋白質組的研究。 4.胰腺組織的多維液相色譜質譜研究。使用離子交換色譜(ionexchangechromatography,IEC)對樣品進行預分離，再用SEC-RPLC分離并用MALDI-TOFMS檢測，共檢出300余種不同質荷比的蛋白/多肽分子。該方法靈活簡便，可作為組織樣品蛋白質組研究的通用型方法。 5.胰腺癌標志物的篩選研

7、究。在前述方法基礎上，通過對健康人血清和胰腺癌術前、術后患者血清進行多維色譜分離和MALDI-TOFMS檢測，并以胰旁系癌患者血清檢測結果作為對照，篩選出兩種顯著差異蛋白分子。其中分子量為5734D的蛋白質/多肽在胰腺癌患者血清中呈現明顯上調，陽性檢出率為76.19％，特異性達到80.77％。，分子量為5923D的蛋白質/多肽在胰腺癌患者血清中呈現下調，敏感性達為73.33％。對胰腺癌患者及健康人血清中糖蛋白進行了差異篩選，同樣找出了分