基于激光捕獲顯微切割技術(shù)的垂體泌乳素腺瘤蛋白組學研究.pdf

1、垂體腺瘤在顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率僅低于腦膠質(zhì)細胞瘤和腦膜瘤,約占所有顱腦腫瘤的16.7％,泌乳素(Prolactin,PRL)腺瘤是最常見的功能性垂體腺瘤,約占垂體瘤總數(shù)的25～41%。PRL腺瘤常因過量分泌PRL激素引起一系列組織器官代謝紊亂和功能障礙。女性主要癥狀為:閉經(jīng)、泌乳和不孕;男性主要表現(xiàn):視力下降、頭痛和性功能障礙。部分PRL腺瘤呈侵襲性垂體腺瘤是指腫瘤呈浸潤性生長,侵犯硬腦膜、海綿竇、骨質(zhì)等周圍結(jié)構(gòu)甚至極少數(shù)呈惡性腫瘤表現(xiàn)。越

2、來越多的證據(jù)顯示:垂體腺瘤雖然為單克隆起源,但其發(fā)病機制是一個涉及多基因、多蛋白相互作用的結(jié)果。既往針對單一基因或蛋白進行研究,不僅耗時費力且難以全面揭示垂體腺瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制,蛋白組學可以通過高通量的方式在蛋白整體水平揭示垂體腺瘤的發(fā)病機理。目前高通量研究蛋白質(zhì)表達差異的主流技術(shù)是雙向凝膠電泳(Two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE),它根據(jù)蛋白質(zhì)不同特點分兩相分離蛋白質(zhì)。目前國際上已經(jīng)有幾

3、項垂體腺瘤的的差異蛋白質(zhì)組學研究,但鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目很有限,所取樣品均為混合細胞樣品而且2-DE蛋白質(zhì)組學技術(shù)存在操作繁瑣、不穩(wěn)定和低豐度的蛋白不易檢測等缺點。本論文運用激光捕獲顯微切割(Lasercapturemicrodissection,LCM)技術(shù)解決垂體腺瘤蛋白組學的“異質(zhì)性”問題;采用鳥槍法質(zhì)譜(Shot-gun)即2D-LC-MS/MS質(zhì)譜聯(lián)用策略鑒定全蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進行垂體腺瘤蛋白表達譜和比較蛋白組學研究。本論文有四個部

4、分組成第一章概述了質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì)組學的研究策略,包括離子源、質(zhì)譜儀、凝膠質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、多維色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、質(zhì)譜成像為主的分離鑒定技術(shù),對特定細胞進行激光捕獲顯微切割分離技術(shù),以及用于研究差異蛋白質(zhì)的定量蛋白質(zhì)組技術(shù)。在此基礎上提出了本課題的研究內(nèi)容。第二章主要研究垂體PRL腺瘤以及正常垂體的全蛋白表達譜。我們首先通過比較不同濃度TritonX-100和作用時間對冰凍PRL腺瘤和正常垂體免疫組化特異性和陽性率影響,獲得最佳效果導航LC

5、M獲取蛋白組學研究樣品。運用激光捕獲切割獲取的PRL腺瘤(冰凍和福爾馬林固定)以及正常垂體50000-100000PRL陽性細胞,采用尿素和硫脲聯(lián)合或者2%十二胺磺酸鈉(SDS)提取細胞蛋白采用二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LTQ-Orbitrap)進行蛋白表達譜研究。通過串聯(lián)質(zhì)譜鑒定泌乳素腺瘤蛋白表達譜為2243個蛋白。提取福爾馬林固定石蠟包埋泌乳素腺瘤PRL細胞,2%SDS高溫30min提取蛋白后進行二維液相-LTQ-Orbitrap串聯(lián)

6、質(zhì)譜鑒定福爾馬林固定泌乳素腺瘤蛋白表達譜(1521),鑒定肽段和蛋白和冰凍組織表達譜(1652)相比較在多種理化性質(zhì)上具有很大的相似性。本章最后一節(jié)我們運用LCM對解剖獲取的正常垂體內(nèi)PRL細胞進行蛋白表達譜分析,研究結(jié)果表明,鑒定表達譜(1662)在蛋白數(shù)量、蛋白理化性質(zhì)上具有很大的相似性。通過本章研究我們認為:免疫組化圖像導航LCM可以整片獲取純凈PRL細胞,配合紫外線切割帶膜金屬切片,甚至可以獲取單個PRL。獲取細胞形態(tài)良好,腫瘤

7、細胞和間質(zhì)細胞及周圍細胞對比度鮮明,可以為進一步的垂體腺瘤蛋白組學研究提供高質(zhì)量的研究樣品。利用SDS-PAGE進行蛋白預分離可降低蛋白復雜性,增加蛋白鑒定量。二維液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜分析獲取PRL細胞的蛋白組學表達譜是理想的蛋白組學研究方式。蛋白表達譜的研究為以后繼續(xù)深入研究比較蛋白組學奠定了重要基礎。差異蛋白組學的研究可以更好的理解泌乳素腺瘤的發(fā)病和預防,第三章我們通過免疫組化圖像導航LCM獲取實驗所需的PRL細胞,使用新型的

8、iTRAQTM結(jié)合二維高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜(QSTAR)聯(lián)用技術(shù)構(gòu)建了正常垂體及泌乳素腺瘤蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù),共鑒定到263種蛋白質(zhì)表達。計算iTRAQ比率進行蛋白質(zhì)的相對定量比較,以1.4倍為基準,堅定出82個差異蛋白,其中49個蛋白上調(diào)和32個蛋白下調(diào)。通過Western-Blot技術(shù)對HMGB1、Cofilin-1、YWHAE、Vomentin、ANXA5差異蛋白進行驗證,統(tǒng)計結(jié)果顯示差異表達和定量信息基本吻合,這些蛋白與垂體腺瘤的發(fā)

9、生和侵襲性有著密切的關(guān)系。第四章進一步研究差異蛋白在垂體腺瘤發(fā)病機理中的作用,我們通過生物信息軟件DAVID對定量比較蛋白組學鑒定的差異蛋白進行不同功能分類;利用KEGG軟件尋找與鑒定差異蛋白關(guān)系最密切的病理通路。通過DAVID和KEGG生物信息軟件對差異蛋白分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白在定位上主要位于細胞漿,分子功能上與細胞內(nèi)蛋白的組裝和合成、細胞凋亡有關(guān),KEGG顯示差異蛋白與局灶黏附和細胞骨架蛋白調(diào)節(jié)有關(guān)。對差異表達的蛋白質(zhì)進行生物信息學分析