早期與進展期胃癌蛋白組學差異研究.pdf

1、目的：胃癌是目前全球最常見的惡性消化道腫瘤之一，篩查敏感性、特異性高的胃癌腫瘤標志物，能夠達到早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療胃癌的目的，進而明顯改善患者的預后和提高其生存率。目前廣泛用于臨床的腫瘤標志物CEA、CA199、CA724等診斷胃癌的靈敏度和特異性均不理想，而近些年發(fā)現(xiàn)在胃癌中相對特異的標志物 MG7-抗原、胃蛋白酶原在我國胃癌篩查中尚無大樣本的證據(jù)支持。因此，本課題擬通過利用同位素標記相對和絕對定量技術(shù)（iTRAQ）聯(lián)合液相色

2、譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)蛋白組學技術(shù)篩查早期、進展期胃癌和健康人群血清中差異表達的蛋白，并經(jīng)生物信息學分析后篩選出與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的特異蛋白，最后用Western blot和免疫組化方法共同驗證，以期發(fā)現(xiàn)與胃癌分期及預后有關(guān)的蛋白標志物。
　　方法：用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學方法分析具有明顯差異的早期與進展期胃癌患者血清各3例以及2例正常體檢者血清，登陸GO及KEGG數(shù)據(jù)庫對鑒定蛋白質(zhì)進行生物信息學分析。通過蛋白差異表達

3、情況、生物信息學分析并結(jié)合文獻查閱，選定與胃癌發(fā)生發(fā)展、信號轉(zhuǎn)導通路、侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)的差異表達蛋白。然后從早期、進展期胃癌與正常對照各30例血清樣本中各組隨機抽取9例血清，利用Western blot技術(shù)對其中的2個差異蛋白進行驗證。另收集與早期、進展期胃癌血清對應(yīng)的術(shù)后石蠟包埋的胃癌組織及癌旁正常組織各30例，應(yīng)用免疫組化方法對2個差異蛋白進行驗證。最后，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分別采用t檢驗和Kaplan-Meier生存分析法，

4、分析2個差異蛋白的表達與胃癌患者復發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其對預后的影響。
　　結(jié)果： iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學方法共鑒定得到119個差異蛋白質(zhì)（53個上調(diào)，66個下調(diào)）。登陸GO數(shù)據(jù)庫搜索發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要定位于細胞內(nèi)、細胞漿、細胞器及細胞膜等處。其功能與結(jié)合、催化、酶調(diào)節(jié)等相關(guān)。參與的生理和病理生理過程有信號傳導通路、代謝、單細胞生物過程、抗氧化、調(diào)節(jié)通道等。登陸KEGG pathway數(shù)據(jù)庫搜索，它們主要參與MAPK信號通路、P53信

5、號通路等。根據(jù)篩選條件共選出7個關(guān)鍵性差異表達蛋白：IGFBP-3、ARF-1、HRG、PON3、FN1、HGF和CETP，并對其中IGFBP-3與ARF-1蛋白進行相關(guān)驗證。Western blot結(jié)果顯示IGFBP-3蛋白在進展期胃癌血清中的表達低于早期胃癌與正常對照血清中的表達，ARF-1蛋白在進展期胃癌血清中的表達則高于早期胃癌與正常對照血清中的表達，差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均<0.05），兩個差異蛋白在早期血清與正常對照血清

6、中的表達，經(jīng)比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。免疫組化結(jié)果顯示IGFBP-3蛋白與ARF-1蛋白陽性表達均定位于細胞漿及部分細胞核。IGFBP-3在組織中的表達水平與Western blot結(jié)果一致，ARF-1在進展期胃癌組織中的表達與早期胃癌、正常對照組織中的表達比較結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，且ARF-1在早期組表達水平也高于正常組表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義（P值<0.05）。IGFBP-3與胃癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)，A

7、RF-1與胃癌的臨床分期、復發(fā)轉(zhuǎn)移均相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均<0.05）。生存分析顯示：IGFBP-3陰性表達患者的平均生存時間明顯小于陽性表達患者的平均生存時間，而ARF-1陰性表達患者的平均生存時間明顯大于陽性表達患者的平均生存時間，差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均<0.05）。
　　結(jié)論：本實驗應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學iTRAQ技術(shù)研究初步篩選了早期胃癌、進展期胃癌與正常人血清中的差異蛋白，得到了胃癌血清差異表達蛋白質(zhì)譜，共

8、發(fā)現(xiàn)了119個差異蛋白。重點篩選出了7個關(guān)鍵性差異蛋白：IGFBP-3、ARF-1、HRG、PON3、FN1、HGF和CETP。對其中IGFBP-3與ARF-1兩個差異蛋白進行相關(guān)驗證，發(fā)現(xiàn)IGFBP-3蛋白在進展期胃癌患者的組織和血清中均表達下調(diào)，且與胃癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移和預后相關(guān)；ARF-1蛋白在胃癌患者的組織和血清中均表達上調(diào)，且與胃癌的臨床分期、復發(fā)轉(zhuǎn)移和預后相關(guān)。ARF-1可能是潛在的價值較大的胃癌腫瘤標志物，IGFBP-3雖為胃癌