早期與進(jìn)展期胃癌蛋白組學(xué)差異研究.pdf

1、目的：胃癌是目前全球最常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤之一，篩查敏感性、特異性高的胃癌腫瘤標(biāo)志物，能夠達(dá)到早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療胃癌的目的，進(jìn)而明顯改善患者的預(yù)后和提高其生存率。目前廣泛用于臨床的腫瘤標(biāo)志物CEA、CA199、CA724等診斷胃癌的靈敏度和特異性均不理想，而近些年發(fā)現(xiàn)在胃癌中相對(duì)特異的標(biāo)志物 MG7-抗原、胃蛋白酶原在我國(guó)胃癌篩查中尚無(wú)大樣本的證據(jù)支持。因此，本課題擬通過(guò)利用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（iTRAQ）聯(lián)合液相色

2、譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)蛋白組學(xué)技術(shù)篩查早期、進(jìn)展期胃癌和健康人群血清中差異表達(dá)的蛋白，并經(jīng)生物信息學(xué)分析后篩選出與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的特異蛋白，最后用Western blot和免疫組化方法共同驗(yàn)證，以期發(fā)現(xiàn)與胃癌分期及預(yù)后有關(guān)的蛋白標(biāo)志物。
　　方法：用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析具有明顯差異的早期與進(jìn)展期胃癌患者血清各3例以及2例正常體檢者血清，登陸GO及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過(guò)蛋白差異表達(dá)

3、情況、生物信息學(xué)分析并結(jié)合文獻(xiàn)查閱，選定與胃癌發(fā)生發(fā)展、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、侵襲轉(zhuǎn)移等相關(guān)的差異表達(dá)蛋白。然后從早期、進(jìn)展期胃癌與正常對(duì)照各30例血清樣本中各組隨機(jī)抽取9例血清，利用Western blot技術(shù)對(duì)其中的2個(gè)差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。另收集與早期、進(jìn)展期胃癌血清對(duì)應(yīng)的術(shù)后石蠟包埋的胃癌組織及癌旁正常組織各30例，應(yīng)用免疫組化方法對(duì)2個(gè)差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。最后，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分別采用t檢驗(yàn)和Kaplan-Meier生存分析法，

4、分析2個(gè)差異蛋白的表達(dá)與胃癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其對(duì)預(yù)后的影響。
　　結(jié)果： iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法共鑒定得到119個(gè)差異蛋白質(zhì)（53個(gè)上調(diào)，66個(gè)下調(diào)）。登陸GO數(shù)據(jù)庫(kù)搜索發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要定位于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞漿、細(xì)胞器及細(xì)胞膜等處。其功能與結(jié)合、催化、酶調(diào)節(jié)等相關(guān)。參與的生理和病理生理過(guò)程有信號(hào)傳導(dǎo)通路、代謝、單細(xì)胞生物過(guò)程、抗氧化、調(diào)節(jié)通道等。登陸KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，它們主要參與MAPK信號(hào)通路、P53信

5、號(hào)通路等。根據(jù)篩選條件共選出7個(gè)關(guān)鍵性差異表達(dá)蛋白：IGFBP-3、ARF-1、HRG、PON3、FN1、HGF和CETP，并對(duì)其中IGFBP-3與ARF-1蛋白進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。Western blot結(jié)果顯示IGFBP-3蛋白在進(jìn)展期胃癌血清中的表達(dá)低于早期胃癌與正常對(duì)照血清中的表達(dá)，ARF-1蛋白在進(jìn)展期胃癌血清中的表達(dá)則高于早期胃癌與正常對(duì)照血清中的表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均<0.05），兩個(gè)差異蛋白在早期血清與正常對(duì)照血清

6、中的表達(dá)，經(jīng)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。免疫組化結(jié)果顯示IGFBP-3蛋白與ARF-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)均定位于細(xì)胞漿及部分細(xì)胞核。IGFBP-3在組織中的表達(dá)水平與Western blot結(jié)果一致，ARF-1在進(jìn)展期胃癌組織中的表達(dá)與早期胃癌、正常對(duì)照組織中的表達(dá)比較結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，且ARF-1在早期組表達(dá)水平也高于正常組表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值<0.05）。IGFBP-3與胃癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)，A

7、RF-1與胃癌的臨床分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移均相關(guān)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均<0.05）。生存分析顯示：IGFBP-3陰性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間明顯小于陽(yáng)性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間，而ARF-1陰性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間明顯大于陽(yáng)性表達(dá)患者的平均生存時(shí)間，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均<0.05）。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)研究初步篩選了早期胃癌、進(jìn)展期胃癌與正常人血清中的差異蛋白，得到了胃癌血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜，共

8、發(fā)現(xiàn)了119個(gè)差異蛋白。重點(diǎn)篩選出了7個(gè)關(guān)鍵性差異蛋白：IGFBP-3、ARF-1、HRG、PON3、FN1、HGF和CETP。對(duì)其中IGFBP-3與ARF-1兩個(gè)差異蛋白進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)IGFBP-3蛋白在進(jìn)展期胃癌患者的組織和血清中均表達(dá)下調(diào)，且與胃癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)；ARF-1蛋白在胃癌患者的組織和血清中均表達(dá)上調(diào)，且與胃癌的臨床分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。ARF-1可能是潛在的價(jià)值較大的胃癌腫瘤標(biāo)志物，IGFBP-3雖為胃癌