高耐酸性巴氏醋桿菌的差異蛋白組學(xué)研究.pdf

1、眾所周知，典型的代謝產(chǎn)物乙酸在其濃度低于5％就具有細(xì)胞毒性。醋酸菌由于其高耐酸性而被常用于醋酸發(fā)酵工業(yè)中。本文以巴氏醋酸菌為研究對(duì)象，補(bǔ)料發(fā)酵長(zhǎng)期馴化出耐高醋酸濃度的醋酸菌，并研究在高酸度培養(yǎng)下對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，從而在細(xì)胞水平上探究高酸度對(duì)微生物造成的差異。建立醋酸菌總蛋白標(biāo)準(zhǔn)圖譜的雙向電泳體系，利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定高酸度脅迫下的差異蛋白，從而在分子水平上解釋長(zhǎng)期適應(yīng)高濃度醋酸對(duì)微生物的影響和醋酸菌的耐酸性蛋白變化機(jī)制

2、。為食醋產(chǎn)業(yè)提高醋產(chǎn)量，減少成本消耗，提高醋酸菌的耐酸性提供科學(xué)依據(jù)。
　　探討不同酸度對(duì)醋酸菌的影響，分析Na+/K+-ATP酶活性以及在高酸度和低酸度下對(duì)醋酸菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，酸度越高Na+/K+-ATP酶活性越高，醋酸濃度醋酸菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)造成明顯影響，對(duì)部分酸度太高的細(xì)菌可能由于細(xì)胞內(nèi)容物和無(wú)機(jī)鹽外漏而致死，一部分為了適應(yīng)這高酸度而發(fā)生變異。
　　建立巴氏醋桿菌總蛋白質(zhì)雙向電泳體系。優(yōu)化了蛋白樣

3、品制備、裂解液配方、IPG膠條pH范圍、鹽橋搭建、等電聚焦程序、上樣量、染色方法等因素。利用超聲破碎與TCA-丙酮沉淀相結(jié)合的樣品制備方法制備蛋白質(zhì)樣品;裂解液配方中添加Tris和DTT;17cm pH4～7的IPG膠條;上樣120μg;搭建鹽橋;延長(zhǎng)除鹽時(shí)間(2h)和等電聚焦時(shí)間(80000 vhr);銀染。建立了醋酸菌總蛋白雙向電泳體系。
　　采用雙向電泳-生物質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學(xué)，研究了不同酸度下(43，74，96g/L)醋酸菌

4、的總蛋白組的變化，差異蛋白點(diǎn)有111個(gè)，從中篩選出36個(gè)具有代表性的蛋白點(diǎn)，進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、簽定出蛋白點(diǎn)26個(gè)。蛋白點(diǎn)主要是乙醇脫氫酶類、PQQ-乙醇脫氫酶輔酶、醛酮還原酶、果糖二磷酸醛縮酶、過(guò)氧化氫還原酶類、熱激蛋白類、外膜蛋白類、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子蛋白類。PQQ-乙醇脫氫酶類主要是將乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸。醛酮還原酶類是醋酸菌發(fā)酵中催化醛類物質(zhì)的還原反應(yīng)，還可以催化酮類物質(zhì)的還原反應(yīng)，還可以解毒。果糖二磷酸醛縮酶

5、，存在于合成代謝途徑如糖異生途徑和戊糖磷酸循環(huán)途徑，為生物體物質(zhì)合成代謝提供能量ATP和底物。過(guò)氧化氫還原酶類一種抗氧化蛋白，能夠分解過(guò)氧化物，通過(guò)其過(guò)氧化物還原酶活性來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受過(guò)氧化氫、烷基過(guò)氧化物等活性氧的攻擊。熱激蛋白類是應(yīng)激蛋白，功能是防止蛋白質(zhì)變性，使其恢復(fù)原有的空間構(gòu)象和生物活性。外膜蛋白是革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜上的重要組成部分，參與細(xì)胞膜的形成、維持細(xì)菌形態(tài)、新陳代謝等功能。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在細(xì)菌細(xì)胞中具有調(diào)控功能，調(diào)節(jié)參與