家蠶馬氏管蛋白組學及重要酶類的功能分析.pdf

1、屬于鱗翅目昆蟲的家蠶，體內(nèi)物質(zhì)的代謝的重要器官-馬氏管與其他昆蟲的馬氏管(腎管)乃至哺乳動物的腎臟有著很大的相關(guān)性，也具有其獨特的特征。對于家蠶馬氏管重要功能性蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和研究可以為我們更好地理解昆蟲馬氏管(腎管)的功能，在漫長的進化過程中，因為不同的進化需要，昆蟲和哺乳動物共有和不同的進化結(jié)果。另外，作為能夠大量吐絲結(jié)繭的昆蟲，家蠶的巨大經(jīng)濟價值已長久被人們所關(guān)注。代謝作為消化過程后的必要環(huán)節(jié)，其與家蠶生長發(fā)育的調(diào)節(jié)作用不容忽視。因

2、此，對于家蠶馬氏管的研究對于提高家蠶體質(zhì)，進而提高產(chǎn)絲效率和產(chǎn)絲量可以起到一個很好推動作用。而且，家蠶馬氏管具有顯著區(qū)段特征的特殊構(gòu)造對于研究馬氏管(腎管)不同區(qū)段的功能提供了很好的條件。
　　 本研究利用丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結(jié)合液相質(zhì)譜(LC MS/MS)、雙向電泳(2D)結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜(2D-MALDI-TOF/MS)的方法分析了家蠶五齡第5天馬氏管的主要表達蛋白質(zhì)；并對五齡第5天的各段馬氏管、五齡

3、第5天與化蛹第1天整段馬氏管的表達蛋白質(zhì)進行了比較；還對蛾期馬氏管代謝產(chǎn)物中存在的主要蛋白質(zhì)進行了鑒定；利用家蠶的基因組序列、表達序列標簽(ESTs)數(shù)據(jù)以及基因芯片數(shù)據(jù)，對具有顯著時期和區(qū)段分布特點的蛋白質(zhì)BmAGXT2、BmHYI、Bmhibadh的編碼基因Bmagxt2、Bmhyi、Bmhibadh進行了克隆和分析；同時采用RT-PCR、原核表達、Western blotting等技術(shù)對Bmagxt2、Bmhyi的功能進行了研究；

4、測定了BmAGXT2在馬氏管五齡期到蛹期、五齡期各區(qū)段中的酶活力。
　　 1.家蠶馬氏管五齡第5天LC MS/MS及2D-MALDI-TOF MS分析
　　 LC MS/MS液向-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定復雜蛋白質(zhì)混合物的技術(shù)現(xiàn)在已廣泛應用在蛋白質(zhì)組學平臺中。在本研究中采用了LTQ VELOS質(zhì)譜儀，成功的鑒定了家蠶五齡第5天馬氏管表達蛋白質(zhì)。我們采用了構(gòu)建正反庫的方式和TPP軟件的篩選功能對鑒定結(jié)果進行了質(zhì)量控制，增加了蛋白的鑒定

5、可信度。最終，我們一共鑒定到了1367個非重復蛋白質(zhì)，其中80.54％的鑒定蛋白質(zhì)理論分子量分布在10-100kD之間，98.90％的鑒定蛋白質(zhì)的理論等電點分布在4-12之間；而家蠶9倍基因組預測的所有蛋白質(zhì)中有82.48％的理論分子量分布在10-100 kD之間，97.82％的理論等電點分布在4-12之間。其中有41個蛋白質(zhì)同時在雙向電泳中檢測到，且這些蛋白質(zhì)在雙向電泳圖譜中發(fā)現(xiàn)的表達量和APEX分析結(jié)果相似。我們對這些蛋白質(zhì)進行了家

6、族分類、GO分類、pathway分類后發(fā)現(xiàn)：家蠶的馬氏管不僅完成了調(diào)節(jié)體內(nèi)水分和鹽分的作用，除了功能相似之外，其與哺乳動物的腎臟在多個代謝通路上有著相似之處，并且二者可能還有更多的關(guān)聯(lián)。作為專一食桑葉的昆蟲，家蠶選擇了以馬氏管作為場所來完成對桑葉揮發(fā)油成分的代謝。在馬氏管中的GSTs、P450s、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenases)等蛋白質(zhì)家族來處理外源性和內(nèi)源性的有害物質(zhì)，達到機體免受其傷害的目的。
　　

7、 2.五齡第5天馬氏管分段雙向電泳與質(zhì)譜分析及代謝產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的鑒定
　　 通過顏色觀察和查閱文獻，我們發(fā)現(xiàn)家蠶馬氏管至少可以分為3個區(qū)段，對這三個區(qū)段分別進行DAPI染色30 min后的結(jié)果顯示，第Ⅰ區(qū)段染色主要集中在馬氏管管腔內(nèi)側(cè)；第Ⅱ區(qū)段染色質(zhì)呈網(wǎng)狀分布；第Ⅲ區(qū)段染色質(zhì)呈顆粒狀分布。說明這3個區(qū)段有較大的區(qū)別。為了了解馬氏管各區(qū)段的蛋白質(zhì)分布情況，分別對這3個區(qū)段進行了雙向電泳，我們發(fā)現(xiàn)BmAGXT2、BmHYI、Bmhi

8、badh、BmActin3在各區(qū)段中有較大差異，其中BmAGXT2主要分布于第1區(qū)段(遠離直腸端)，第2區(qū)段、第2區(qū)段中分布較少；BmHYI、Bmhibadh在第1區(qū)段的分布量也大于其他區(qū)段；而BmActin3在第3區(qū)段中的量最大。
　　 在研究中，我們對化蛾第2天馬氏管內(nèi)容物中的蛋白質(zhì)情況進行了雙向電泳-質(zhì)譜分析，成功鑒定到其中3個蛋白點，均為典型的抗菌肽蛋白質(zhì)hemolin，推測可能蛹期及蛾期免疫有關(guān)。
　　 3.家

9、蠶幼蟲期和蛹期馬氏管差異蛋白質(zhì)組學分析
　　 利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)對家蠶五齡第5天及化蛹第1天的馬氏管組織進行比較，并采用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對表達量差異較大的蛋白點進行肽指紋圖譜鑒定，應用GPMAW8.00軟件對NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中所有來自于P50/Dazao的蛋白質(zhì)與家蠶9倍基因組預測蛋白質(zhì)庫共同構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫，對試驗采集到的肽指紋圖譜進行分析。共檢測到360～430個蛋白點，主要分布

10、在分子質(zhì)量15～80 kD、等電點4.0～9.5的范圍內(nèi)。兩個時期共有17個表達量有顯著差異的蛋白質(zhì)被成功鑒定，其中包括與能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)、熱激蛋白、V型H+ATP合酶、30K蛋白以及與腎臟功能密切相關(guān)的丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶2(BmAGXT2)，3-羥基異丁酸脫氫酶(Bmhibadh)等。研究結(jié)果可以為家蠶馬氏管怎樣實現(xiàn)從幼蟲期代謝桑葉消化產(chǎn)物功能為主到蛹期代謝消耗脂肪體及儲藏蛋白的產(chǎn)物功能為主的巨大轉(zhuǎn)變提供蛋白質(zhì)水平上的依據(jù)。<

11、br>　　 4.Bmagxt2、Bmhyi、Bmhibadh基因的克隆、序列分析及mRNA表達
　　 根據(jù)基因組中Bmagxt2、Bmhyi、Bmhibadh的序列，設計引物，克隆基因，經(jīng)過酶切和測序驗證得到三個基因的陽性克隆。從基因結(jié)構(gòu)上分析，Bmagxt2基因CDS長為2080 bp，編碼的蛋白含260個氨基酸殘基，預測蛋白的分子量大小為50.38 kD，等電點為7.70，具有9個外顯子，8個內(nèi)含子，在基因組上僅有一個拷貝

12、，位于11號染色體nscaf3031上。SignalP預測沒有信號肽，為分泌型蛋白；TMHMM預測沒有跨膜結(jié)構(gòu)。Bmhyi基因CDS長為783 bp，編碼的蛋白含260個氨基酸，預測蛋白的分子量大小為29.17 kD，等電點為6.10，含有4個外顯子，3個內(nèi)含子，在基因組上僅有一個拷貝，位于nscaf2360上，染色體定位情況未知。SignalP預測沒有信號肽，為分泌型蛋白；TMHMM預測沒有跨膜結(jié)構(gòu)。Bmhibadh基因CDS長為96

13、9 bp，編碼的蛋白含322個氨基酸殘基，預測蛋白的分子量大小為34.01 kD，等電點為9.24，含有6個外顯子，5個內(nèi)含子，在基因組上僅有一個拷貝，位于17號染色體nscaf2865上。SignalP預測信號肽為第1-21個氨基酸殘基(MAARTILSTQCLYTAARRAYS)；TMHMM預測前60個氨基酸殘基為跨膜結(jié)構(gòu)。
　　 為了了解三個基因在家蠶各時期、組織的表達特征，我們利用家蠶ESTs、基因芯片數(shù)據(jù)以及RT-PC

14、R方法進行了分析。ESTs分析結(jié)果顯示Bmagxt2、Bmhyi、Bmhibadh均具有EST證據(jù)。在家蠶馬氏管、中腸中Bmagxt2有EST證據(jù)。在家蠶卵巢、血細胞、馬氏管、中腸、脂肪體、絲腺中Bmhyi有EST證據(jù)，在家蠶中腸、翅原基、馬氏管、胚胎、血細胞、脂肪體、絲腺中Bmhibadh有EST證據(jù)。
　　 對家蠶全基因組芯片的組織表達數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示：Bmagxt2基因在家蠶五齡第3天的各組織中的mRNA的量都很低，除卵

15、巢、精巢、脂肪體這三個組織有極少量外，其他組織中幾乎沒有mRNA的存在。Bmhyi基因在絲腺、卵巢、精巢、馬氏管、體壁、頭、血液、脂肪體、中腸中均有不同程度的表達，其中絲腺中表達量較低，而馬氏管、血液、脂肪體、中腸中表達量較高，尤其馬氏管中表達量很高。Bmhibadh基因在在家蠶五齡第3天的各組織中幾乎沒有表達。對早期胚胎和熟蠶期到蛾期的芯片數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示：Bmhibadh發(fā)育時期、早期胚胎無數(shù)據(jù)。Bmagxt2基因在胚胎早期和上蔟

16、第8-9天有很微弱量的表達，其他時期幾乎不表達；Bmhyi基因在整個胚胎期、熟蠶期至蛾期都沒有表達。
　　 為了進一步補充和驗證表達譜，我們進行了半定量RT-PCR檢測。結(jié)果顯示：Bmagxt2基因在家蠶五齡第3天幼蟲生殖腺、體壁、脂肪體表達量較高，在頭和馬氏管中有微弱表達；而從1齡眠期到五齡第7天的期間內(nèi)均有表達。Bmhyi基因在家蠶五齡第3天幼蟲脂肪體、表皮、血細胞中有微弱表達，馬氏管中表達量較高；而從蟻蠶期到上蔟后第10天

17、期間都有表達，整體表現(xiàn)為幼蟲期表達量大于蛹期，上蔟后36-72 h表達量小于上蔟后96 h到上蔟后第10天。Bmhibadh基因在家蠶五齡第3天幼蟲各組織中均有表達，馬氏管和絲腺中的表達量略高于其他組織；而在幼蟲期各時間點均有一定量表達，總體趨勢表現(xiàn)為眠期表達量小于起蠶期；上蔟后該基因幾乎無表達，一直到上蔟后第8天才有極微弱的表達量，并一直保持到蛾期。
　　 5.Bmagxt2、Bmhyi的原核表達、抗體制備及western b

18、lotting檢測
　　 為了對基因功能進行進一步研究，我們將Bmagxt2和Bmhyi分別與p29和p28表達載體相連接，相應命名為Bmagxt2/p29和Bmhyi/p28，并轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達菌株中。IPTG誘導表達后分別得到分子量約為51 kD和30 kD的重組包涵體蛋白質(zhì)，而目標蛋白質(zhì)分子量約為50.38 kD和29.17 kD，加上6個組氨酸標簽，大小約為51 kD和30 kD，與預測分子量大小基本一致。<

19、br>　　 通過Ni+親和柱和電洗脫純化，得到了較高濃度的原核表達包涵體蛋白質(zhì)BmAGXT2、BmHYI。將這兩個蛋白質(zhì)免疫成年健康雄兔后，取得血清，純化得到多克隆抗體。利用抗體檢測Bmagxt2和Bmhyi在家蠶五齡第5天各組織的表達情況，結(jié)果顯示，BmAGXT2蛋白質(zhì)在馬氏管和血液中有表達，尤其在馬氏管中表達量很高，這與我們在雙向電泳試驗中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象一致。Bmhyi蛋白質(zhì)只在馬氏管中有表達。而進一步的雙向western blott

20、ing結(jié)果顯示，與五齡第5天相比較，化蛹第1天馬氏管中的BmAGXT2和BmHYI都有很大程度的減少，這一結(jié)果之前的雙向電泳中觀察的結(jié)果一致。
　　 6.丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶2(BmAGXT2)活性檢測
　　 為了研究BmAGXT2蛋白在馬氏管中的活性情況是否與其表達量具有相關(guān)性，我們參照其在人和小鼠同源蛋白的酶活性測定方法，測定了BmAGXT2從五齡第3天到化蛹第7天以及其在五齡第5天馬氏管各區(qū)段中的酶活性，結(jié)果顯