蘿卜低溫弱光脅迫響應(yīng)的蛋白組學(xué)與基因差異表達(dá)研究.pdf

1、蘿卜(Raphanus sativus L.)又名蘆菔、萊菔，是起源于我國(guó)的一種重要十字花科根菜類蔬菜。由于其栽培面積大、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，在我國(guó)的蔬菜生產(chǎn)供應(yīng)中居于重要的地位。低溫脅迫是決定作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要限制因子，太陽(yáng)光是光合作用的能量來(lái)源，是植物生存的基礎(chǔ)，植物的光合作用依賴光。低溫弱光脅迫嚴(yán)重影響著蔬菜作物的生長(zhǎng)，已經(jīng)成為限制蔬菜類產(chǎn)量的重要因素。
　　 低溫弱光脅迫，作為主要的非生物脅迫，嚴(yán)重影響著植物生長(zhǎng)發(fā)育、地理分布

2、以及農(nóng)作物的產(chǎn)量。蛋白質(zhì)組學(xué)在后基因組時(shí)代發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，雙向電泳(2-DE)技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)的支撐之一，被應(yīng)用于生物學(xué)研究的許多領(lǐng)域。蘿卜喜溫性作物，特別是在冬春季保護(hù)地生產(chǎn)中低溫弱光成為限制蘿卜產(chǎn)量品質(zhì)的重要因子，目前有關(guān)蘿卜響應(yīng)低溫弱光脅迫機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。本研究以蘿卜高代自交系‘NAU-JLQX’為材料，比較兩種葉片蛋白質(zhì)提取方法，以獲得適合蘿卜葉片蛋白質(zhì)提取的方法;利用雙向電泳技術(shù)，分離低溫弱光脅迫前后蘿卜葉片差異

3、表達(dá)的蛋白，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜鑒定與功能分析，并對(duì)相應(yīng)基因進(jìn)行RNA水平上的表達(dá)特性分析;利用mRNA差異顯示技術(shù)，進(jìn)行低溫弱光下蘿卜葉片差異表達(dá)基因的分離鑒定，對(duì)部分低溫弱光脅迫響應(yīng)基因進(jìn)行了克隆與轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析;利用同源克隆技術(shù)克隆蘿卜低溫調(diào)控的相關(guān)基因，并進(jìn)行低溫脅迫下的基因表達(dá)分析，從而為解析植物響應(yīng)低溫弱光脅迫的分子遺傳機(jī)制提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　 采用Tris-HCl-TCA/丙酮沉淀法和改進(jìn)的PEG分

4、級(jí)沉淀法提取蛋白質(zhì)，通過(guò)雙向凝膠電泳比較兩種蛋白質(zhì)提取方法的效果。結(jié)果表明，以pH4-7的17cm線性IPG膠條進(jìn)行IEF，上樣量1000μg/350μl，蛋白質(zhì)可以得到較好的分離，2-DE凝膠圖譜質(zhì)量最佳;改進(jìn)的PEG分級(jí)沉降法提取的葉片總蛋白質(zhì)，所提取三個(gè)組分的2-DE凝膠圖譜可清晰識(shí)別的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)目分別為537、170以及852，而Tris-HCl/TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)2-DE凝膠圖譜可識(shí)別出640個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。
　

5、　 采用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)，進(jìn)行蘿卜葉片響應(yīng)低溫(LT，5℃/2℃)弱光(WE，100μmol m-2 s-1)脅迫(分別處理0h，24 h以及96h)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究。共鑒定19個(gè)蛋白點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)鑒定的蛋白點(diǎn)主要參與了碳的新陳代謝(OEE2，RuBisCO大亞基，RuBisCO小亞基以及CA)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(NDPK2)，蛋白質(zhì)合成(60S核糖體蛋白)，以及植物防御系統(tǒng)(CP)。對(duì)其中10個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)相應(yīng)的基因進(jìn)行半定量RT-PC

6、R分析，結(jié)果表明在mRNA水平上與蛋白質(zhì)水平的表達(dá)特性相一致。
　　 采用mRNA差異顯示(DDRT-PCR)技術(shù)，分離蘿卜‘NAU-JLQX’低溫弱光(100μmol m-2 s-1)脅迫前后差異表達(dá)的基因?？偣部寺〉玫?2條差異片段，其中17條與已知功能基因有較高的同源性。有2個(gè)是轉(zhuǎn)錄因子，2個(gè)參與光合作用，4個(gè)參與防衛(wèi)與脅迫響應(yīng)，1個(gè)參與轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，5個(gè)參與蛋白結(jié)合，1個(gè)為蛋白激酶以及1個(gè)參與表達(dá)調(diào)控。這些結(jié)果都表明低溫弱光

7、脅迫是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在這一過(guò)程中，許多生理生化過(guò)程都受到影響。
　　 根據(jù)不同作物抗冷相關(guān)基因保守域設(shè)計(jì)特異引物，以蘿卜(')NAU-YH’為材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到了四個(gè)冷馴化相關(guān)基因DNA及cDNA序列，分別命名為Rs-COR14，Rs-MYB4以及Rs-LOS2。分析其核苷酸序列表明，它們分別與擬南芥COR14，MYB4，以及LOS2具有較高的同源性。半定量RT-PCR結(jié)果表明，低溫弱光脅迫開(kāi)始后，在對(duì)照中不表達(dá)的R