蘿卜鎘脅迫響應的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、蘿卜(Raphanus sativus L)為起源于我國的一種重要的根菜類蔬菜作物。重金屬是蔬菜生產(chǎn)中最隱蔽、最難控制的污染源之一，鎘(Cd)是生物毒性極強的重金屬之一，過量的鎘進入環(huán)境參與水體-土壤-生物系統(tǒng)循環(huán)，并通過食物鏈而被動物和人體攝入，嚴重威脅人體健康。隨著環(huán)境污染問題的日益突出，鎘污染已嚴重影響蘿卜的安全生產(chǎn)。目前，植物對鎘脅迫的響應機理已成為國內(nèi)外學者研究的重要課題。蛋白質(zhì)組學在后基因組時代發(fā)揮著越來越重要的作用。雙向電

2、泳(2-DE)技術作為蛋白質(zhì)組學的支撐之一，被應用于生物學研究的許多領域。目前在蛋白質(zhì)水平上闡述蘿卜對鎘脅迫響應機理的研究還非常少。
　　 本研究以蘿卜高代自交系‘NAU-RG’為材料，首先對蘿卜蛋白質(zhì)提取方法進行篩選優(yōu)化、建立起蘿卜蛋白質(zhì)提取體系，為蘿卜蛋白質(zhì)組學的深入開展奠定了基礎，利用雙向電泳技術研究了蘿卜葉片和根組織在不同濃度的鎘脅迫下的蛋白質(zhì)差異表達情況，并對根組織中差異非常顯著的點進行了質(zhì)譜鑒定與功能分析，利用半定量

3、RT-PCR技術，對部分鎘脅迫響應基因進行了克隆與轉(zhuǎn)錄水平的表達分析，為揭示蘿卜鎘脅迫響應機理提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：⑴將5種在植物蛋白質(zhì)提取中常用的方法應用于蘿卜葉片的蛋白質(zhì)提取，并進行適當優(yōu)化，建立了蘿卜葉片與根組織的蛋白質(zhì)提取技術體系：葉片蛋白質(zhì)提取方法為Tris-HCl/TCA-丙酮法；利用正交實驗方法對根組織蛋白質(zhì)提取方法-改良的酚提取法進行了優(yōu)化。⑵利用營養(yǎng)液水培的方式對蘿卜幼苗進行重金屬鎘處理，處理濃度為0mg·

4、L-1CdCl2.2.5H2O，50mg·L-1CdCl2·2.5H2O，100mg·L-1CdCl2·2.5H2O。獲取實驗材料，利用雙向電泳技術分析鎘脅迫條件下蘿卜葉片的蛋白質(zhì)組的響應情況，在蘿卜葉片中共檢測到10個差異表達的蛋白質(zhì)點，其中有1個被Cd脅迫條件誘導表達，2個上調(diào)表達，5個下調(diào)表達，1個消失，1個在低濃度處理時下調(diào)，高濃度時上調(diào)。在蘿卜根組織中共檢測到31個差異表達的蛋白質(zhì)點，經(jīng)MALDI-TOF/TOF成功鑒定23個

5、蛋白點，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索表明，細胞防衛(wèi)相關蛋白占差異表達的蛋白質(zhì)的56.5％，細胞代謝相關蛋白占30.4％，信號轉(zhuǎn)導相關蛋白占8.7％。⑶根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，選擇3個已知功能的差異蛋白質(zhì)--蛋白質(zhì)二硫化異構(gòu)酶(Protein disulfide isomerase)、磷酸甘油酸酯激酶(Phosphoglycerate kinase)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)，利用半定量RT-PCR對編碼這三個蛋白的基因(Rs