蚯蚓蛋白質雙向電泳技術的建立及菲脅迫下的蛋白質組學研究.pdf

1、本實驗通過對蚯蚓蛋白質提取方法的比較,選擇合適的樣品制備方案,并對IPG膠條pH范圍,等電聚焦時間,上樣量等雙向電泳條件進行優(yōu)化,建立了適用于蚯蚓(Eisenia fetida)組織蛋白質的雙向電泳技術條件。對蚯蚓進行菲的亞急性毒性試驗,采用建立的雙向電泳條件進行蚯蚓菲脅迫下蛋白質差異表達分析,并對部分差異表達蛋白質進行了種類鑒定,為后續(xù)開展蚯蚓蛋白質組學研究以及菲污染脅迫下土壤生物標志物的篩選奠定了研究基礎。
　　 研究結果表

2、明,改良后的TCA/丙酮沉淀法比裂解液提取法提取蚯蚓組織蛋白質效果更佳,雜質去除能力更好,所得雙向電泳圖譜分辨率較高,更適用于蚯蚓組織全蛋白質雙向電泳樣品制備。
　　 蚯蚓蛋白質組雙向電泳的最佳條件為:組織通過改良的TCA/丙酮沉淀法提取總蛋白,選用pH范圍4～7的IPG膠條,考馬斯亮藍凝膠染色時最佳上樣量為600μg,等電聚焦時間10h。所得雙向電泳圖譜蛋白點豐富,背景清晰,可鑒定蛋白點超過450個。
　　 對蚯蚓進行

3、23mg/kg菲污染20d,30d和40d三個不同時間點的自然土壤亞急性毒性實驗,通過自行建立的雙向電泳技術條件對蚯蚓蛋白質進行表達差異分析,分別獲得顯著性差異蛋白點14,22和35個,且差異蛋白表達下降趨勢明顯,并出現部分表達上調的蛋白質。選取5個差異蛋白點進行質譜分析,鑒定結果分別為ATP結合盒式蛋白,DNA修復酶RadA,磷酸絲氨酸轉氨酶,帶4.1蛋白和一個未知功能蛋白,這些蛋白質分別參與了免疫調控、遺傳修復、能量代謝以及細胞骨架