牛羊乳蛋白質(zhì)的雙向電泳分析及免疫檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、牛乳和山羊乳作為最常見(jiàn)的兩種乳源，是人類重要的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。牛羊乳蛋白質(zhì)的差異往往導(dǎo)致加工特性的不同，也是區(qū)別檢測(cè)牛羊乳的主要目標(biāo)物質(zhì)。本課題以牛羊乳的蛋白質(zhì)為主要研究對(duì)象，采用單向和雙向電泳的技術(shù)分析比較了牛羊乳蛋白質(zhì)的異同，應(yīng)用蛋白組學(xué)研究技術(shù)對(duì)牛乳和山羊乳中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析鑒定和相應(yīng)的生物信息學(xué)分析探討，以牛乳β-乳球蛋白（β-LG）為檢測(cè)對(duì)象研究膠體金免疫層析快速檢測(cè)試紙條。本文研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　牛羊乳聚丙烯酰胺

2、凝膠電泳研究。以脫脂牛羊乳為樣品，分別進(jìn)行非變性（Native）、變性還原（SDSR）、變性非還原（SDSNR）條件單向電泳以及Native:SDSNR-PAGE和SDSNR:SDSR-PAGE雙向電泳，比較牛羊乳圖譜異同。在Native-PAGE圖譜中，牛羊乳蛋白差異主要表現(xiàn)在β-LG條帶上，牛乳的β-LGA和β-LGB條帶可以作為區(qū)別牛羊乳的特征條帶。SDS-PAGE圖譜中，αs1-CN和αs2-CN由于含量差異而表現(xiàn)出的電泳條帶差

3、別是區(qū)別牛羊乳的主要特征。單向電泳圖譜結(jié)合Native:SDSNR-PAGE和SDSNR:SDSR-PAGE雙向電泳圖譜顯示，加熱會(huì)使牛羊乳中熱敏性蛋白發(fā)生變性聚合，熱處理越劇烈，蛋白變性聚合程度越高。其中β-LG易與κ-CN以及αs2-CN以二硫鍵形式聚合形成聚合體分布于酪蛋白膠束表面以及乳清相中。而牛羊乳由于蛋白含量差異，聚合體的分布比例略有不同。加壓條件也會(huì)促使β-LG與酪蛋白的結(jié)合，羊乳由于清蛋白含量較高，此種聚合現(xiàn)象更加明顯。

4、
　　牛羊乳蛋白組學(xué)研究。以脫脂牛羊乳和牛羊乳清為樣品，進(jìn)行IEF:SDS-PADE雙向電泳，分別得到總蛋白和清蛋白的雙向電泳指紋圖譜。結(jié)果顯示，牛羊乳在蛋白種類上的差異并不明顯，但同種類蛋白在2-DE圖譜中的電泳行為卻不相同。牛羊乳2-DE圖譜區(qū)別較大的蛋白主要有αs1-CN、αs2-CN、κ-CN以及β-LG，其主要區(qū)別體現(xiàn)在含量上的差異、蛋白自身變異體存在以及蛋白質(zhì)磷酸化修飾導(dǎo)致的等電點(diǎn)差異。通過(guò)選定2-DE凝膠中蛋白點(diǎn)進(jìn)行

5、酶解質(zhì)譜分析及蛋白組查庫(kù)匹配分析鑒定，確定了牛羊乳主要酪蛋白及清蛋白在2-DE圖譜中的位置及相應(yīng)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)信息數(shù)據(jù)。乳清蛋白中鑒定出大量的牛乳和羊乳的低豐度蛋白，比如牛乳絲氨酸蛋白酶、維生素D結(jié)合蛋白、α-1-抗糖蛋白以及羊乳α-2-HS-糖蛋白等。對(duì)牛羊乳的五種大量蛋白進(jìn)行的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和表位分析結(jié)果表明，牛羊乳同種蛋白抗原表位均存在差異，實(shí)現(xiàn)特定表位片段識(shí)別是牛羊乳蛋白的區(qū)別檢測(cè)基礎(chǔ)。
　　免疫檢測(cè)技術(shù)研究。選取牛乳α-

6、CN、α-LA、β-CN和β-LG作為抗原制備的抗體α-CN-IgG、α-LA-IgG、β-CN-IgG和β-LG-IgG的效價(jià)分別為1:204800、1:204800、1:3200和1:25600。競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定四種抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，四種抗體的半抑制濃度分別為9.2mg/mL、1.4mg/mL、5281.8mg/mL和48.4mg/mL。交叉反應(yīng)測(cè)試結(jié)果顯示β-LG-IgG抗體有較高的特異性。選擇β-LG-IgG研制檢測(cè)牛乳β

7、-LG的膠體金免疫層析試紙條，其膠體金最佳標(biāo)記pH為8.0，最佳蛋白標(biāo)記量為25μg/mL。試紙條的NC膜選擇Sartorius CN140，金標(biāo)墊和樣品墊的封閉劑選擇PEG-20000。C線二抗的包被濃度為1.0mg/mL，T線多抗的包被濃度為1.0mg/mL，金標(biāo)墊上金標(biāo)抗體的涂布濃度為20％。以此條件制備的試紙條可以明確區(qū)分陰性和陽(yáng)性反應(yīng)，其對(duì)β-LG的檢測(cè)靈敏度可達(dá)5μg/mL。
　　通過(guò)對(duì)牛羊乳蛋白質(zhì)的電泳分析及蛋白質(zhì)組