幽門螺桿菌響應環(huán)境脅迫的蛋白質組學研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)主要定植于人胃粘膜上皮細胞，是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因素，與胃癌及胃粘膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤發(fā)生密切相關，1994年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(IARC)已將其列為I類致癌因子。流行病學調查顯示，糞-口途徑是幽門螺桿菌的重要傳播途徑之一，該菌在體內存活及體外傳播過程中必然會遭受到多種環(huán)境壓力的脅迫，細菌通過啟動一系列的適應性調節(jié)機制來抵抗這些脅迫因

2、素以達到保種生存并導致疾病的目的。 幽門螺桿菌的一個顯著特征就是能夠在人胃的極端酸性環(huán)境中生存，人胃腔內的pH值在饑餓時可低達1.0，在自酸性的胃腔向胃粘膜層移動過程中，幽門螺桿菌不可避免的應對pH值的不斷波動?，F(xiàn)今研究較清楚的幽門螺桿菌抗酸機制就是其脲素酶系統(tǒng)，脲素酶可分解脲素產生氨和二氧化碳來提高細菌微環(huán)境的pH值，然而，胃液內的脲素濃度往往約為1mM，僅通過該系統(tǒng)不能完全保證幽門螺桿菌在酸性胃環(huán)境的存活。因此，推測在幽門螺

3、桿菌的酸性應答過程中還存在其它的pH平衡系統(tǒng)。 餐后膽汁返流入胃是一種正常的生理現(xiàn)象，患有胃腸道疾病者此現(xiàn)象更為嚴重；許多研究證明糞-口途徑是幽門螺桿菌進入人體消化道的一種重要途徑，那么在其傳播過程中，幽門螺桿菌必定經過富含膽汁的腸道，耐受并抵抗膽汁對它的脅迫作用；另外，人們利用聚合酶鏈反應和DNA印跡等方法在膽汁，膽囊和肝組織中檢測到幽門螺桿菌的存在。以上均說明幽門螺桿菌對膽汁的耐受性是其在人類胃腸道定植和生存重要機制，幽門螺

4、桿菌通過何種機制在富含膽汁的環(huán)境中生存還不清楚。形態(tài)學改變是細菌抗逆生存的重要調節(jié)機制之一，在O2壓力，低pH值等不利的培養(yǎng)條件下或抗菌治療后，幽門螺桿菌可轉變?yōu)榛畹姆强膳囵B(yǎng)狀態(tài)的球形體，這種形態(tài)學轉變是一種積極的生物學應答過程，是幽門螺桿菌的一種保護性抗逆生存機制。當細菌受到脅迫時也可進入非分裂狀態(tài)，這在醫(yī)學研究上具有重要意義。已有研究證明當細菌的分裂被抑制而它們的生長仍在繼續(xù)時細菌可轉變成絲狀體形態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌在高鹽培養(yǎng)基中

5、于靜止早期可形成絲狀體結構，胺曲南也可以誘導幽門螺桿菌絲狀體的形成。因此，對其絲狀體的研究有可能發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌的細菌分裂檢查點。 基因組學和蛋白質組學技術都是整體的高通量的生物技術體系，它們的興起推動了生命科學各個分支突飛猛進的發(fā)展。蛋白質是生命活動的直接執(zhí)行者，由于翻譯和轉錄后修飾的影響，mRNA水平的變化不能完全反映蛋白質豐度的變化。蛋白質組學研究是在整體水平上高通量的解析基因組所表達的體現(xiàn)生命活動特征的蛋白質的變化規(guī)律，并

6、且蛋白質組學技術已被證實是研究細菌應對各種不同環(huán)境壓力的生理性適應反應的有力工具，幽門螺桿菌的兩個菌株(H.pylori26695和H.pyloriJ99)的全基因組序列已經測序完成，為了充分利用這些生物信息學資源，本研究通過高通量的比較蛋白質組學分析了幽門螺桿菌在酸，膽汁等壓力條件下及幽門螺桿菌非分裂狀態(tài)絲狀體的蛋白質表達變化，旨在為闡明幽門螺桿菌在體內外的生存機制提供有價值的理論基礎。 本學位論文的主要研究內容及實驗結果如下

7、： 一.幽門螺桿菌在無脲素存在時對酸性脅迫的蛋白質反應酸性脅迫是幽門螺桿菌在人胃內面臨的最大挑戰(zhàn)，當幽門螺桿菌暴露于酸性環(huán)境時，脲素酶系統(tǒng)是其保持胞內及胞質pH接近于中性的基本調節(jié)機制，然而，胃液內的脲素濃度往往在1mM左右，僅僅通過分解脲素不足以有效保證幽門螺桿菌應對酸的脅迫，因此推測幽門螺桿菌還存在其它的酸性調節(jié)機制。為了鑒定除脲素酶以外幽門螺桿菌存在的抗酸相關的蛋白分子，我們利用雙向凝膠電泳技術比較了該細菌在pH7.4，6

8、.0，5.0，4.0，3.0及2.0條件下暴露30分鐘后的蛋白質表達譜，差異性的蛋白進行MAlDI-TOF-TOF質譜分析，共得到36個具有不同功能的蛋白質分子的信息。這些蛋白參與產氨，分子伴侶，能量代謝，細胞外膜，信號調節(jié)等多種生物學功能，還有一些蛋白質的功能至今仍不清楚，然后我們對差異性的蛋白進行了SOM分析，結果顯示幽門螺桿菌通過多種蛋白的改變響應酸性脅迫。二.幽門螺桿菌對人膽汁脅迫的蛋白質反應幽門螺桿菌對膽汁的耐受能力是其在人胃

9、腸道的定植和存活的重要機制，由于膽汁返流入低pH的胃內可被酸化，因此本研究首先檢測了膽汁酸化前后對幽門螺桿菌抑制能力的改變，結果顯示膽汁的酸化后對幽門螺桿菌的抑制活性降低。然后，通過雙向凝膠電泳得到幽門螺桿菌在正常條件下及在膽汁和酸化膽汁脅迫下的蛋白質表達譜，差異性蛋白進行MALDI-TOF-TOF質譜分析，結果發(fā)現(xiàn)與正常條件下的菌體蛋白相比，膽汁及酸化膽汁脅迫下的蛋白質表達譜的變化規(guī)律相似。膽汁和酸化膽汁的存在使幽門螺桿菌28個菌體蛋

10、白質的表達發(fā)生變化，并且大多數(shù)蛋白是誘導表達。這些蛋白包括分子伴侶蛋白，參與鐵離子儲存的蛋白，趨化性蛋白，與能量代謝相關的酶類及編碼鞭毛裝置的蛋白等，這說明幽門螺桿菌通過對多種信號分子的調節(jié)應對膽汁和酸化膽汁的脅迫。為了證實某些蛋白在幽門螺桿菌膽汁耐受中的作用，我們構建了Hp0721和鞭毛馬達開關蛋白的基因缺失突變株，經檢測發(fā)現(xiàn)兩個突變株對膽汁脅迫的抵抗力有所降低，說明這兩個蛋白在幽門螺桿菌的膽汁調節(jié)反應中起一定作用。 三.胺曲

11、南誘導的非分裂狀態(tài)幽門螺桿菌絲狀體的蛋白質組學分析處于壓力環(huán)境中，細菌可進入非分裂狀態(tài)，這在醫(yī)學上具有重要意義。本研究利用胺曲南誘導了非分裂狀態(tài)的幽門螺桿菌絲狀體，細胞分裂時FtsI基因編碼細胞壁上參與肽聚糖交聯(lián)的一種轉肽酶，是一種青霉素結合蛋白，胺曲南可抑制該蛋白的功能從而阻止細胞分裂。我們運用實時熒光定量PCR檢測了FtsI和其它幾個青霉素結合蛋白(Hp0597，Hp1565，Hp1372，Hp1373)在幽門螺桿菌絲狀體中的表達情

12、況，結果顯示FtsI在幽門螺桿菌絲狀體中低表達，而其它幾個青霉素結合蛋白的表達水平與螺桿狀細菌相比并無明顯差異。為了尋找幽門螺桿菌可能存在的其它細胞分裂檢查點，我們利用雙向凝膠電泳技術比較了能夠正常分裂的螺桿狀和處于非分裂狀態(tài)的幽門螺桿菌絲狀體的蛋白質表達譜，在絲狀體中具有差異表達的蛋白質斑點通過MALDI-TOF-TOF質譜分析，得到21個蛋白質的信息。其中有一個與細胞分裂相關的蛋白在幽門螺桿菌絲狀體中被誘導表達，該蛋白是由MinD基