炭疽桿菌A16R免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的研究.pdf

1、炭疽是由炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis,BA)引起的一種烈性人畜共患傳染病。由于炭疽芽孢易于大量培養(yǎng)、極難被殺滅、可通過氣溶膠途徑傳播,并且引起的吸入性肺炭疽死亡率較高等特點(diǎn),所以長(zhǎng)期以來一直被某些國(guó)家認(rèn)為是首選的生物戰(zhàn)劑。自美國(guó)“911”事件發(fā)生后,BA研究再次成為世界各國(guó)關(guān)注的熱點(diǎn)。而預(yù)防炭疽最有效的方法是疫苗,所以炭疽疫苗的研究成為目前研究的熱點(diǎn),而從BA中篩選具有免疫原性的蛋白質(zhì)則是疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。本研究采用

2、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法,大規(guī)模篩選BA營(yíng)養(yǎng)體和芽孢蛋白中可能存在的免疫原性蛋白質(zhì),這將為我們深化炭疽芽孢桿菌的認(rèn)識(shí),以及檢測(cè)、診斷炭疽芽孢桿菌與對(duì)炭疽的早期治療提供靶標(biāo)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.BA芽孢的制備
　　 以BA A16R菌株為實(shí)驗(yàn)菌株,采用固態(tài)培養(yǎng),在含有200 mL的LB固態(tài)培養(yǎng)基的羅氏瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng),先放于37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)正置一天后,再倒置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10-15 d,用4℃滅菌純水清洗培養(yǎng)基表面,

3、8000 r/min離心10 min收集芽孢,直至復(fù)紅美蘭染色觀察芽孢純度達(dá)到98％為止。然后將收集的芽孢用2 mL的4℃滅菌純水重懸,稀釋涂板計(jì)數(shù),得到芽孢濃度為5.5×109 CFU/mL。
　　 2.抗炭疽的多克隆抗體的制備
　　 以收集純化的芽孢免疫4只新西蘭大白兔,首次家兔腹股溝免疫,間隔14 d后耳靜脈免疫2次,后來采用皮下多點(diǎn)免疫,且免疫相隔7 d,共免疫5次,以間接ELISA測(cè)定血清效價(jià)達(dá)到12800。免

4、疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了,所制備的血清可以與炭疽蛋白發(fā)生反應(yīng),所以制備出的血清為下一步篩選具有免疫原性的蛋白點(diǎn)提供了材料。
　　 3.BA營(yíng)養(yǎng)體蛋白與芽孢蛋白的制備及免疫印跡分析
　　 采用超聲裂解方法分別制備BAA16R菌株的營(yíng)養(yǎng)體和芽孢蛋白樣品,蛋白樣品經(jīng)雙向電泳分離,電轉(zhuǎn)膜后,用上述制備的多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡。然后將雙向電泳的考馬斯亮藍(lán)染色膠圖與免疫印跡曝光圖匹配比對(duì),找出匹配的蛋白點(diǎn)后,進(jìn)行膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明