豬胸膜肺炎放線桿菌免疫蛋白質(zhì)組學(xué)及亞單位疫苗的研究.pdf

1、豬胸膜肺炎放線桿菌是引起豬胸膜肺炎的主要病原,該病原引起的豬傳染性胸膜肺炎是一種具有高度傳染性的呼吸道病,世界各國均有發(fā)生,給世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該菌的15個血清型均能致病,防制難度較大。我國流行的優(yōu)勢血清型是1、2、3、7型,本實驗室已完成了對血清3型JL03株的全基因組測序工作?；谝陨匣A(chǔ),本研究旨在應(yīng)用反向疫苗學(xué)技術(shù)篩選豬胸膜肺炎放線桿菌保守的免疫原性蛋白,結(jié)合新型O/W佐劑MF59研究具有交叉保護(hù)效果的亞單

2、位疫苗。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.豬胸膜肺炎放線桿菌免疫原性蛋白的篩選與鑒定
　　 應(yīng)用免疫蛋白質(zhì)組技術(shù)對豬胸膜肺炎放線桿菌血清3型JL03株進(jìn)行了研究,用康復(fù)血清從其外膜蛋白和分泌蛋白中篩選到33個具有免疫反應(yīng)性的蛋白,分泌蛋白16種,外膜蛋白17種,其中有三種蛋白MomP1、MomP2、EF-Tu在分泌蛋白和外膜蛋白中同時被鑒定。在鑒定的30個免疫原性蛋白中有6個蛋白是已知的抗原蛋白,24個蛋白是豬胸膜肺炎

3、放線桿菌的新型免疫原性蛋白。新型免疫原性蛋白中已經(jīng)在其它病原中表現(xiàn)出免疫原性的蛋白有D15/OmpD、LppB、FrdA、MDH、FepA、FrpB、TufB、PotD、GapA、ZnuA、TIG、DegP、TufB、PsaA、FkpA、PTA；有一部分蛋白在本研究究中被首次鑒定為免疫原性蛋白,但其功能在一些細(xì)菌中已經(jīng)得到證實,這些蛋白是CbiK、IlvG、FepB、AfuC、FatB、GGBP、CysG、Ttg2D。
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4、.免疫原性蛋白亞細(xì)胞定位及小鼠免疫保護(hù)效果評價
　　 對篩選到的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析后,我們選取了通過間接免疫熒光試驗證實分布于APP表面的蛋白OmpD、LppB、FepA作為研究對象,對其基因進(jìn)行體外的克隆和表達(dá),純化后的蛋白通過小鼠免疫攻毒試驗進(jìn)行評價,結(jié)果表明,免疫小鼠在APP1型菌株攻毒后,OmpD、LppB對小鼠的保護(hù)率均為70％,FepA對小鼠的保護(hù)率僅為40％。
　　 3.亞單位疫苗的研究
　　

5、ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ是APP重要的毒素及抗原蛋白,應(yīng)用本實驗室構(gòu)建保存的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)這三種毒素蛋白的抗原部份.ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅢA,將純化的rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA與對小鼠免疫保護(hù)率較高的rOmpD、rLppB組合,與新型佐劑MF59混合制備成抗原含量不同的兩種亞單位疫苗,疫苗Ⅰ(各抗原組份50μg/ml)和疫苗Ⅱ(各抗原組份75μg/ml)。
　　 用小鼠模型對疫苗Ⅰ、Ⅱ進(jìn)行安全性和免疫效

6、果評價。采用2倍免疫劑量腹腔接種小鼠后,觀察14天,小鼠采食、精神狀態(tài)無異常,表明疫苗Ⅰ、Ⅱ?qū)π∈笫前踩?。之后用制備好的疫苗Ⅰ、Ⅱ和疫苗?商品化的油佐劑滅活疫苗含血清1、2、7型菌株)對小鼠先后進(jìn)行兩次免疫,于不時間對亞單位疫苗各組份抗原的特異性抗體水平進(jìn)行檢測,并對IgG抗體亞類IgG1和IgG2a進(jìn)行檢測,在二免后10天使用我國優(yōu)勢血清型APP1、2、3、7型標(biāo)準(zhǔn)菌株5LD50劑量對免疫組和對照組小鼠進(jìn)行攻毒。結(jié)果顯示,使用疫苗

7、Ⅰ、Ⅱ免疫的小鼠各抗原組份抗體水平均極顯著的高于滅活疫苗,這主要是由于滅活疫苗中不含有ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅢA這三種毒素蛋白,而OmpD和LppB蛋白在整個菌體蛋白中所占的比例不高所致；在整個免疫過程中,疫苗Ⅰ、Ⅱ免疫的小鼠均能產(chǎn)生較高的IgG1、IgG2a抗體水平,表明疫苗Ⅰ、Ⅱ能誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生特異的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng),但I(xiàn)gG1的抗體水平顯著的高于IgG2a的水平,說明疫苗Ⅰ、Ⅱ免疫小鼠后所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)偏向于以

8、Th2型免疫反應(yīng)為主；疫苗Ⅰ、Ⅱ組在1、2、3、7型菌株5LD50劑量攻毒后,免疫小鼠肺臟沒有明顯的解剖學(xué)病理變化,僅在1型菌株攻毒組觀察到有輕微的組織學(xué)病理變化,疫苗Ⅲ組小鼠用1、2、7型菌株攻毒后沒有明顯的解剖病變,也無明顯的組織病理學(xué)變化；用3型菌株進(jìn)行攻毒后,疫苗Ⅲ組的小鼠出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的解剖學(xué)病理變化,出血壞死明顯,相應(yīng)的組織病理學(xué)變化也較明顯,肺泡間質(zhì)增厚,大量炎性胞細(xì)浸潤,肺泡充血、出血。疫苗Ⅰ、Ⅱ組對各血清型攻毒保護(hù)率比

9、較接近,在70％～90％之間,大多為80％；疫苗Ⅲ組對1、2、7型菌株的攻毒保護(hù)率均達(dá)到了100％,但對3型菌株的攻毒保護(hù)率僅40％。
　　 此外,在疫苗Ⅲ組免疫小鼠的肝臟表面覆蓋有白色的油狀物,可能是滅活疫苗中含有不能被機(jī)體吸收的油佐劑造成的。而在使用MF59佐劑的疫苗Ⅰ、Ⅱ組均沒有觀察到這種現(xiàn)象,推測本研究中使用的MF59水包油佐劑具有易被降解吸收的優(yōu)點。
　　 上述研究結(jié)果表明,本研究中的亞單位疫苗對小鼠是安全的,