豬胸膜肺炎放線桿菌OmpD、ApxⅣA蛋白表達及其免疫原性初步研究.pdf

1、豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）屬于巴氏桿菌科（Pasteurella），放線桿菌屬(Actinobacillus)?？梢l(fā)豬胸膜肺炎或胸膜炎，死亡率高，由于APP血清型多，交叉保護力差，目前沒有完全有效的疫苗。為研制高效疫苗，本試驗表達了ApxⅣA和OmpD蛋白并初步研究了其免疫原性。
　　1.OmpD基因的擴增及其生物信息學分析
　　根據(jù)GeneBank上3型A

2、PP全基因中的D15/omp基因序列，設計一對特異性引物，利用PCR方法擴增獲得了1806 bp基因序列。通過DNAstar比對分析，核苷酸同源性為99.4％～99.8％，氨基酸同源性在98.7％～99.5％之間，同源性極高。生物信息學預測結果表明其抗原性和穩(wěn)定性良好。
　　2.OmpD截短基因原核表達
　　在APP OmpD基因序列擴增基礎上，構建了重組表達質粒pET32a-ompD，并轉入Rosetta感受態(tài)細胞，經0.

3、4mmol/L IPTG誘導4.5 h，表達出大小約為87KD帶有His標簽的包涵體蛋白。Western Blot試驗顯示初步純化的蛋白反應原性良好，為小鼠免疫試驗提供抗原基礎。
　　3.ApxⅣA蛋白表達及間接ELISA優(yōu)化
　　以2.5μg/mL rApxⅣA包被酶標板，5％明膠封閉2h;血清稀釋度為1∶50，作用60 min;酶標二抗稀釋度為1∶3000，反應1.5h條件最佳。陰陽性血清臨界值為0.697。運用建立的E

4、LISA方法和凝集試驗分別對江西部分地區(qū)規(guī)?；i場不同階段的147份血清樣品進行檢測，母豬和公豬APP抗體陽性率分別為97.47％、98.73％，肥豬陽性率皆為100％，保育豬陽性率分別為18.75％、12.50％，小豬的陽性率分別為26.19％、7.14％，兩者檢測結果基本一致，說明建立的ELISA方法具有一定的可行性。
　　4.ApxⅣA和OmpD蛋白免疫原性初步研究
　　本試驗分別表達了ApxⅣA和OmpD蛋白，與弗氏