豬胸膜肺炎放線桿菌tbpB基因的克隆、表達(dá)及其對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效力研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要呼吸道傳染病。轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白B(transferrin binding proem B，tbpB)是APP重要的毒力因子和定殖因子。本研究對(duì)APP1型菌tbpB基因進(jìn)行了克隆與原核表達(dá)，對(duì)重組TbpB蛋白的免疫原性及對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效力進(jìn)行了研究，研究?jī)?nèi)容如下： 1．APP轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白B基因克隆、表達(dá)及免疫原性研究 試驗(yàn)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，采用PCR 方法擴(kuò)增APP1 參考株(shop

2、e)tbpB全基因，克隆到pMD19-T Simple vector中，對(duì)其進(jìn)行了序列測(cè)定。將tbpB基因亞克隆進(jìn)入pET-32a(+)表達(dá)載體，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-tbpB，并轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)進(jìn)行表達(dá)，最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為 0.2mmol/L，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為1h，重組TbpB蛋白大小為84KD，以包涵體和可溶蛋白兩種形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，但以包涵體為主。用組氨酸純化試劑盒對(duì)重組TbpB蛋白進(jìn)行純化，其含量為0.3

3、66mg/ml。免疫印跡試驗(yàn)顯示重組TbpB蛋白與兔抗APP1型高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有反應(yīng)原活性。 2．重組TbpB蛋白對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效力研究 將重組 TbpB 蛋白與APP1型菌甲醛滅活苗+重組TbpB蛋白分別于第1天、14天免疫小鼠，以ELISA方法檢測(cè)免疫前、后小鼠rTbpB-ELISA抗體滴度。在首免及二免后，兩組試驗(yàn)組重組TbpB抗體滴度都有升高。混合疫苗免疫組與重組TbpB蛋白免疫組在二免后的陽