豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxIC基因缺失突變株的構(gòu)建.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(APP)引起的高度接觸性呼吸道傳染病，該病對我國的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前疫苗免疫接種是預防和控制該病的主要措施之一，而生產(chǎn)上使用的全菌滅活疫苗和亞單位疫苗并不能降低其發(fā)病率，對異源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保護。APP的自然感染能夠誘導動物機體產(chǎn)生抗異源血清型的保護，因此弱毒活疫苗研究是APP疫苗研究的重要研究方向。本試驗進行了豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxⅠC基因缺失減毒

2、株的構(gòu)建研究。
　　 APP正負篩選表達盒構(gòu)建從APP5、枯草芽孢桿菌和質(zhì)粒pEGFP-N1中分別PCR擴增omlA基因啟動子(omlaP)、果聚糖蔗糖酶基因(sacB)和卡那霉素抗性基因(Kanr)，其基因大小分別為266bp、1422bp、795bp。試驗分別將擴增到的omlaP、sacB和Kanr基因片段TA克隆至pMD19-T中，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定正確后，按omlaP、sacB、Kanr的排列順序酶切連接到載體pB

3、luescriptⅡSK+的XhoⅠ與KpnⅠ酶切位點之間，構(gòu)建成載體pBS-OSK，該載體上的omlaP、sacB、Kanr三個插入片段共同組成了正負篩選表達盒。經(jīng)過卡那霉素抗性實驗，表明含有pBS-OSK質(zhì)粒的大腸桿菌具有Kan抗性；蔗糖敏感性實驗表明含有pBS-OSK載體的大腸桿菌對蔗糖敏感。本試驗表明成功構(gòu)建了以卡那霉素抗性基因(Kanr)和枯草芽胞桿菌的果聚蔗糖酶基因(sacB)的正負雙向篩選系統(tǒng)。
　　 重組轉(zhuǎn)移載體

4、pBOSK△IC的構(gòu)建以APP5K17株基因組為模板，PCR擴增包括ApxⅠC基因上游2895bp和下游1434bp序列作為重組轉(zhuǎn)移載體的左、右同源臂，將擴增到的片段TA克隆至pMD19-T，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定正確后，酶切連接到載體pBS-OSK的SacⅠ、SaⅡ位點之間，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確，試驗成功構(gòu)建了缺失457bp的ApxⅠC基因的APP5K17株重組轉(zhuǎn)移載體pBOSK△IC。
　　 2、APPApxⅠC基因缺失

5、突變株的構(gòu)建
　　 試驗以電轉(zhuǎn)化方法將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBOSK△IC轉(zhuǎn)化到APP血清5型k17株親本菌，在TSB中培養(yǎng)3h后將細菌均勻涂布在含卡那霉素TSA平板培養(yǎng)18h，從平板上篩選具有卡那霉素抗性的菌落，再將具有卡那霉素抗性菌落接種到10％蔗糖的TSA平板鑒定對蔗糖的敏感性，在證實菌落Kan抗性、蔗糖敏感的菌做PCR鑒定。隨機挑選一株鑒定正確的菌落接種于無卡那霉素的TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，以促進第二次同源重組，把培養(yǎng)物稀釋后涂布

6、含10％蔗糖不含卡那霉素的TSA瓊脂平板，將篩選的蔗糖抗性菌落轉(zhuǎn)印到TSA-10％Sucrose-Kan平板，篩選對卡那霉素敏感、蔗糖抗性的菌落做PCR鑒定，最終篩選到一株鑒定正確的AxpIC基因缺失突變株(K17△IC)。遺傳穩(wěn)定性試驗證實突變株在體外連續(xù)傳10代基因能夠穩(wěn)定遺傳。溶血活性試驗證實突變株體外培養(yǎng)不表現(xiàn)溶血活性；細胞毒性試驗證實突變株的細胞毒減弱：缺失株的LD50為1.12×109，親本株LD50為6.09×107。這些