豬傳染性胸膜肺炎重組亞單位疫苗的研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的以肺出血、壞死和纖維素性滲出為主要病變的高度接觸性傳染病。由于APP極易產(chǎn)生耐藥性，疫苗接種是防控本病的主要措施。目前，國內(nèi)主要使用滅活疫苗預(yù)防和控制本病。但由于APP血清型較多，滅活疫苗的保護(hù)效果十分有限。因此，開發(fā)新型疫苗已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

2、研究表明，通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建的一些PCP弱毒疫苗和新興起的一種ghosts疫苗較滅活疫苗的免疫保護(hù)效果有明顯提高，但這兩種疫苗也存在一些問題，弱毒疫苗隨著毒力降低，其免疫原性也有所降低，且存在毒力返強(qiáng)的可能性，而ghosts疫苗則存在菌體裂解不徹底等缺點(diǎn)。 以天然提取的APP毒力因子為組份的亞單位疫苗則不存在上述缺點(diǎn)，且這種疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)，但就其制備方法而言，存在著提取成本高、產(chǎn)量低和不適于大量生產(chǎn)等缺點(diǎn)。鑒于

3、此，本試驗(yàn)通過基因工程方法，重組表達(dá)APP的多種毒力因子，制備多組份重組亞單位疫苗，并進(jìn)行了免疫保護(hù)效果的探討。 研究表明，APP分泌的外毒素(ApxI、ApxⅡ、ApxⅢ)和外膜蛋白(OMP)等不僅是APP重要的毒力因子，同時(shí)也是重要的免疫原性因子，它們已經(jīng)作為4種重要的候選抗原應(yīng)用于APP亞單位疫苗的研究，但APP菌毛(ApfA)和最近發(fā)現(xiàn)的的外毒素IV(ApxV)作為APP的另外兩個(gè)重要毒力因子，尚未見其應(yīng)用于亞單位疫苗的

4、研究報(bào)道。根據(jù)ApfA在定居宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮的重要作用及ApxIV能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體水平這一點(diǎn)，推測二者可能會(huì)在交叉保護(hù)方面起促進(jìn)作用。因此，本試驗(yàn)首次將Apfa和ApxIV也作為疫苗組份進(jìn)行了研究，并首次制備以4種和6種重組蛋白為組份的重組亞單位疫苗，通過對(duì)BALB/c小鼠的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，與滅活疫苗進(jìn)行了保護(hù)效力的比較。具體試驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果如下： 1采用PCR方法分別從APP2型S1536株、APP1型72-1株和A

5、PP7型25-4株中擴(kuò)增到APP的重要保護(hù)性抗原基因apxⅢ4(3114bp)，apxIVA(2553bp)和omp(963bp)。序列測定后與GenBank發(fā)表的其他菌株進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明，所擴(kuò)增的apxⅢA基因與血清2型和血清8型405株的核苷酸同源性分別為98.4％和97.8％，氨基酸同源性分別為98.9％和97.1％；apxIVA基因與血清1型4074株和3型HV114株的核苷酸同源性分別為99.9％和99.2％；氨基酸同

6、源性分別為99.9％和98.9％；omp基因與血清3型S1421株、血清6型Femo株和血清7型WF83株的核苷酸同源性分別為98.3％、98.2％和100％，氨基酸同源性分別為98.8％、98.8％和100％。以上結(jié)果說明所擴(kuò)增的日的基因在不同血清型之間非常保守，尤其是apxIVA和omp基因。 2成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pGEX-apxⅢA，pGEX-apxⅣA和pGEX-omp。并將6種重組表達(dá)載體pGEX-apxⅢA，pG

7、EX-apxIVA、pGEX-omp、pGEX-apxIA、pGEX-apxⅡA和pGEX-apfa(后三種為實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好)分別在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得6種重組蛋白GST-ApxI(rApxI)、GST-ApxⅡ(rApxⅡ)、GST-ApxⅢ(rApxⅢ)、GST-ApxⅣ(rApxIV)、GST-Apfa(rApfa)和GST-OMP(rOMP)，大小分別約116、110、140、118、42和62Ku。

8、Western-blot分析表明，6種重組蛋白具有良好的抗原性。 3將rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP組合作為疫苗Ⅰ組，rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxIV、rApfa和rOMP組合作為疫苗Ⅱ組，APP1型菌制備的滅活疫苗作為疫苗Ⅲ組，PBS作為空白對(duì)照組，進(jìn)行小鼠的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)。免疫共分3次，每次間隔兩周。第3次免疫后第7d，分別以APP1型菌(5×109cfu)和APP2型菌(5×1010cfu)

9、進(jìn)行攻毒。通過檢測血清特異性抗體、脾淋巴細(xì)胞增殖及L-2水平的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)合攻毒后小鼠的存活率、肺臟病理變化及間接免疫熒光的抗原定位，綜合評(píng)價(jià)重組亞單位疫苗的免疫保護(hù)效果。結(jié)果表明，疫苗Ⅰ組的抗體水平、脾淋巴細(xì)胞增殖水平及IL-2水平均顯著高于其他3組(P＜0.05)，且疫苗Ⅰ組對(duì)APP1型菌攻毒的保護(hù)率(9/10)明顯高于疫苗Ⅰ組(5/10)、疫苗Ⅲ組(6/10)和空白對(duì)照組(0/10)，對(duì)APP1型和APP2型菌攻擊后的肺臟保護(hù)作州