傳染性法氏囊病分子佐劑靶向提呈亞單位疫苗的研制.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的以破壞雞的中樞免疫器官—法氏囊為一種高度接觸性傳染病，主要會(huì)導(dǎo)致雞的免疫力下降，進(jìn)而對(duì)一些病原的易感性增強(qiáng)，并導(dǎo)致一些疫苗免疫的失敗。
　　VP2蛋白是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，主要暴露在核衣殼的外面，攜帶了病毒主要的中和性抗原表位，它能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生針對(duì)IBDV的中和性抗體，這種抗體能保護(hù)易感雞使其免受IBDV的感染。LT是產(chǎn)毒性大腸埃希菌產(chǎn)生一種不耐熱腸毒素，具有很強(qiáng)的

2、免疫原性和黏膜免疫佐劑活性，但是經(jīng)過(guò)基因定點(diǎn)突變后的LT不僅沒有毒性而且仍然保持了良好的黏膜佐劑活性。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)是活化T細(xì)胞的表面的一種跨膜糖蛋白分子，而CTLA-4胞外區(qū)能與抗原遞呈細(xì)胞上的B7配體結(jié)合，但不傳遞負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)。因此，用CTLA-4胞外區(qū)融合抗原免疫動(dòng)物，不僅能誘導(dǎo)堅(jiān)強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，而且能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　若將IBDV主要免疫保護(hù)性抗原VP2、大腸桿菌LT去毒突變體(mLT)

3、及雞CTLA-4胞外區(qū)基因片段融合，構(gòu)建通用融合表達(dá)載體pET-mLTA-VP2-CTLA-4-MCS-IgV，此融合蛋白能否協(xié)同發(fā)揮各自的生物學(xué)特性具有很大的臨床研究?jī)r(jià)值。
　　為獲得細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)胞外區(qū)序列，我們根據(jù)GenBank發(fā)表的CTLA-4基因序列設(shè)計(jì)引物，利用重疊延伸PCR方法引入了5個(gè)酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組載體pET-CTLA-4-MCS-IgV，然后克隆入去毒大腸埃希菌不耐熱腸毒素(mL

4、TA)基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體pET30a-mLTA-CTLA-4，測(cè)序鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE檢測(cè)時(shí)清晰可見約42.5 kD的目的蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組菌pET30a-mLTA-CTLA-4構(gòu)建成功。
　　為了構(gòu)建IBDV VP2融合表達(dá)重組菌pET-mLTA-VP2-CTLA-4-MCS-IgV，比對(duì)GenBank發(fā)表的IBDV VP2基因序列，進(jìn)行基因優(yōu)化后合成VP2基因

5、，將其克隆入研究一制備的質(zhì)粒載體pET-mLTA-CTLA-4-MCS-IgV，經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)時(shí)清晰可見約92KD的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相一致，表明重組菌pET-mLTA-VP2-CTLA-4-MCS-IgV構(gòu)建成功，為進(jìn)一步開發(fā)IBDV亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)，且經(jīng)Western-blot分析證實(shí)表達(dá)的重組蛋白mLTA-CTLA-4和mLTA-VP2-CTLA-4抗原性良好。

6、r>　　為了研究融合蛋白mLTA-VP2-CTLA-4的免疫保護(hù)效果以及作為IBD新型亞單位疫苗的可行性，將表達(dá)的mLTA-CTLA-4、mLTA-VP2-CTLA-4兩種蛋白純化后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將360只10日齡非免疫健康雛雞隨機(jī)平均分為6組，第1、2、3組用不同劑量的mLTA-VP2-CTLA-4融合蛋白肌肉注射免疫;第4組mLTA-CTLA-4融合蛋白肌肉注射免疫;第5組只用疫苗免疫;第6組為生理鹽水對(duì)照組。首免后7天加強(qiáng)免疫一次