傳染性法氏囊病病毒VP5缺失減毒株的構(gòu)建.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的急性接觸性傳染病，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。IBDV主要侵害3-8周齡雛雞的中樞免疫器官法氏囊，破壞帶有sIgM的B淋巴細(xì)胞，引起脾臟、胸腺及外周血液淋巴細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致以淋巴細(xì)胞衰竭壞死為主要特征的免疫缺陷性和免疫抑制性疾病。 通過(guò)易感動(dòng)物雛雞，構(gòu)建了一株傳染性法氏囊病病毒基因組節(jié)段雜合病毒。應(yīng)用PCR定點(diǎn)突變方法，在IBDV野毒株ZJ2000株A節(jié)段23

2、66-2371nt引入沉默突變NaeI后，克隆入真核表達(dá)載體pCI，獲得pCI-AKZJ2000，分別制備pCI-AKZJ2000、以及含有細(xì)胞致弱疫苗株HZ2株A和B節(jié)段全長(zhǎng)的真核表達(dá)載體pCI-AKHZ2和pCI-mBHZ2的超純質(zhì)粒。不同組合的上述質(zhì)粒(pCI-AKZJ2000/pCI-mBHZ2和pCI-AKHZ2/pCI-mBHZ2)，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，肌肉途徑分別注射雛雞。通過(guò)血清抗體、病毒抗原和病毒粒子檢測(cè)、雞胚傳代試驗(yàn)、以

3、及分子遺傳標(biāo)記鑒定，表明從雞體內(nèi)拯救出了雜合病毒rAKZJ/HZ和重組病毒Xihu2002株。本試驗(yàn)為IBDV的反向遺傳系統(tǒng)提供了一個(gè)新策略，尤其是對(duì)于不能適應(yīng)細(xì)胞的IBDV強(qiáng)毒株的拯救。結(jié)果還提示IBDV基因組B節(jié)段序列對(duì)病毒毒力具有重要作用，為研究VP1蛋白在病毒復(fù)制和致病中的作用提供了思路。制備了兔抗IBDVVP5多克隆抗體。利用RT-PCR技術(shù)從IBDV地方分離株TL2004株感染雞胚尿囊液中擴(kuò)增到VP5基因，進(jìn)而構(gòu)建了T7啟動(dòng)

4、子控制下的N端GST-Tag融合表達(dá)質(zhì)粒pGEX-VP5。序列測(cè)定表明VP5基因全長(zhǎng)438bp，編碼一個(gè)由145個(gè)氨基酸組成的VP5蛋白。將pGEX-VP5轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG的誘導(dǎo)下高效表達(dá)了GST-VP5融合蛋白(44kD)。通過(guò)包涵體純化的方法，獲得的較高純度的融合蛋白，免疫新西蘭兔，Westernblot和ELISA分析表明，制備的融合蛋白抗血清效價(jià)在1：12800以上，并具有良好的免疫反應(yīng)性，為進(jìn)一步研究VP5在I

5、BDV復(fù)制與致病中的作用，以及IBDVVP5基因缺失病毒打下了良好的基礎(chǔ)。 在上述基礎(chǔ)上，進(jìn)而探索了VP5基因序列及編碼蛋白對(duì)IBDV復(fù)制的影響。通過(guò)PCR定點(diǎn)突變方法，將IBDVHZ2株A節(jié)段ORFA2(VP5)起始密碼子ATG(97-99nt)突變成cTa的同時(shí)，在96-101nt插入NheI酶切位點(diǎn)(GcTaGc)；在此基礎(chǔ)上，分別在另外兩個(gè)A節(jié)段突變體中刪除102-107nt和102-128nt序列。脂質(zhì)體介導(dǎo)下，將含有

6、上述3個(gè)A節(jié)段突變體的真核表達(dá)載體pCI-Nhe1、pCI-Nhe2、pCI-Nhe3，以及pCI-AKHZ2，分別與pCI-mBHZ2共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞。收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)液上清不斷地接種新鮮細(xì)胞，模擬病毒“傳代”，普通光鏡下可以觀察到細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生了類(lèi)似野生IBDV感染細(xì)胞導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)；電子顯微鏡下可以看到符合IBDV病毒粒子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)；間接免疫熒光分析表明所有共轉(zhuǎn)染組傳代細(xì)胞中均有病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，但是

7、只能在pCI-AKHZ2/pCI-mBHZ2共轉(zhuǎn)染組傳代細(xì)胞中觀察到非結(jié)構(gòu)蛋白(VP5)的表達(dá)；RT-PCR、酶切鑒定和序列測(cè)定驗(yàn)證了所引入的分子標(biāo)記，證實(shí)缺陷型IBDV獲得拯救，依次命名為ANhe1、ANhe2和ANhe3。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)比較各毒株在感染性、結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)水平的差異，探討了VP5基因5'端27bp(ORFA1和ORFA2非重疊區(qū))對(duì)病毒復(fù)制的影響。提示VP5蛋白對(duì)病毒的復(fù)制具有調(diào)節(jié)作用；ORFA1和ORFA2非重疊區(qū)序列

8、對(duì)病毒復(fù)制具有很大的影響，推測(cè)該區(qū)域包含或部分包含了一個(gè)基因表達(dá)調(diào)控元件。 進(jìn)一步驗(yàn)證了VP5的缺失對(duì)IBDVANhe2株在雛雞體內(nèi)復(fù)制的影響。14日齡雛雞分別接種IBDVANhe2和HZ2株，接種后按一定時(shí)段收集法氏囊進(jìn)行病理學(xué)和病毒學(xué)檢測(cè)，結(jié)果表明ANhe2株病毒在體內(nèi)可保持遺傳穩(wěn)定性，兩株病毒均只能導(dǎo)致雛雞法氏囊一過(guò)性的輕微病理過(guò)程，其中ANhe2株接種導(dǎo)致的法氏囊萎縮過(guò)程和病理組織學(xué)變化明顯減輕；接種后，兩株病毒均可在法

9、氏囊淋巴細(xì)胞中短暫增殖，并持續(xù)感染一段時(shí)間。ANhe2株病毒的增殖速度相對(duì)較慢，直到感染后7d才出現(xiàn)高峰，而HZ2株出現(xiàn)的增殖過(guò)程非常短暫，在接種后3d，病毒滴度即開(kāi)始明顯下降。結(jié)果表明VP5的缺失導(dǎo)致了IBDVHZ2株病毒的進(jìn)一步減毒，然而VP5的缺失并不能使其毒力完全消失，提示VP5更可能是IBDV復(fù)制的一個(gè)調(diào)節(jié)因子。 VP5的缺失對(duì)IBDVANhe2株誘導(dǎo)機(jī)體保護(hù)性免疫的影響。兩株病毒在28日齡加強(qiáng)免疫后3周，均可對(duì)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)