傳染性法氏囊病病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2和VP3調(diào)控細胞自噬的分子機制研究.pdf

1、自噬是一種細胞內(nèi)保守的蛋白及廢物降解機制，同時也在細胞清除病原的過程中發(fā)揮重要作用。在不同病毒的感染過程中，自噬扮演了不同的角色。至今未見IBDV與自噬關(guān)系的研究。本研究中，我們以DF-1細胞為模型研究了IBDV與細胞自噬的關(guān)系。為了解IBDV感染DF-1細胞后自噬的變化情況，檢測了IBDV感染細胞后內(nèi)源性LC3以及GFP-LC3的變化情況。
　　IBDV感染DF-1和293T細胞后，LC3-Ⅱ在0-2小時表現(xiàn)為顯著的上調(diào)，而在4

2、-6小時下降。同樣的， IBDV感染GFP-LC3轉(zhuǎn)化的DF-1和293T細胞中，GFP-LC3在2小時呈現(xiàn)大量的點狀分布，而在感染后4小時這些點狀結(jié)構(gòu)消失。P62在IBDV感染過程中出現(xiàn)了同步變化。這些數(shù)據(jù)證明在病毒感染早期DF-1和293T細胞的自噬被強烈誘導，在病毒感染4小時后，自噬水平被抑制。綜上所述，IBDV感染在早期誘導了細胞的自噬，而后抑制了細胞自噬。
　　何種因素導致了細胞在感染2小時內(nèi)發(fā)生了自噬，為了解釋這一現(xiàn)象

3、，我們對病毒編碼的蛋白影響自噬的情況進行了分析，證明僅VP2蛋白誘導細胞自噬。然而VP2蛋白通過何種途徑誘導自噬？在研究中，我們發(fā)現(xiàn)病毒蛋白VP2能夠抑制mTOR和AKT的活性。因此，推測VP2蛋白通過細胞表面某一受體連接mTOR/AKT通路，并誘導自噬。實驗證明，受體蛋白Hsp90能夠與IBDV VP2互作，并減弱Hsp90與AKT的互作，導致AKT和Hsp90的解聚，而抑制了AKT和mTOR的活性，這些數(shù)據(jù)證明I BDV通過其外殼蛋

4、白VP2與宿主細胞蛋白Hsp90的互作并因此抑制AKT/mTOR信號途徑活性而激活了自噬。
　　為了進一步揭示IBDV感染細胞后，在激活自噬后又抑制自噬的現(xiàn)象，我們對自噬途徑做了進行了進一步分析，證明IBDV VP3通過其CC1結(jié)構(gòu)域與Beclin-1互作，并把Beclin-1從VPS34復合體中分離下來，從而抑制PI3P的形成。同時VP3能夠促進AKT的磷酸化來促進mTOR的磷酸化。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，VP3能夠誘導VPS34-AK

5、T-PDK1復合體的形成。通過對VPS34的干擾敲低，發(fā)現(xiàn)AKT不再被磷酸化。通過PDK1抑制劑來抑制PDK1的活性，也能發(fā)現(xiàn)AKT不再磷酸化。因此，VPS34-AKT-PDK1復合體的形成對于IBDV/VP3誘導的AKT磷酸化是必須的。同時，發(fā)現(xiàn)PDK1抑制劑能夠逆反因VP3而抑制的自噬，但是PDK1抑制劑無法恢復由VP3破壞的VPS34復合體，因此推測VP3主要是通過促進AKT的活性而非通過破壞VPS34-Beclin-1復合體的方

6、式來抑制自噬的。
　　本文系統(tǒng)的研究了IBDV感染前期和后期細胞自噬的變化情況，在IBDV侵入的過程中，細胞通過Hsp90來識別IBDV的外殼蛋白VP2，并因此引發(fā)mTOR依賴的功能性自噬過程。引發(fā)的自噬在清除病毒中起到重要的作用。而IBDV為了能夠成功復制，在感染過程中，IBDV能夠通過其VP3來促進VPS34依賴的AKT活性，并因此而阻斷自噬，促進病毒的復制。因此，病毒蛋白VP2/VP3通過調(diào)控AKT/mTOR信號通路控制著I