傳染性法氏囊病毒蛋白VP3與靶細(xì)胞泛素-蛋白酶體通路UBC9蛋白的互作鑒定.pdf

1、傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)主要侵害3-5周齡雛雞的體液免疫中樞器官-法氏囊的前B淋巴細(xì)胞，引起感染雞的發(fā)病死亡和免疫抑制，并增加了對其他病原的敏感性。目前對于宿主響應(yīng)IBDV感染的分子機制，尤其是IBDV感染后胞內(nèi)泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin proteasome pathway，UPP)的變化機制知之甚少。本研究以CEF-16細(xì)胞適應(yīng)毒感染DF-1細(xì)胞為模型

2、，鑒定了病毒編碼蛋白與UPP的共定位并分析了它們的相互作用，并從基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯、生物學(xué)活性等不同角度研究了IBDV感染對宿主細(xì)胞UPP的影響，為更好地理解IBDV感染機制與宿主細(xì)胞的抗病毒策略提供了新線索。
　　 1.IBDV編碼蛋白與UPP相互作用分析制備了兔抗UPP相關(guān)蛋白E1、UBC9、CHIP、UCHL1、UCHL5、HIP2、Casp3、Casp8、Casp9、p65、p105、IκB、MHCⅠ和MHCⅡ的多克隆抗

3、體，通過建立雙免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，分析了IBDV感染細(xì)胞中的5種病毒蛋白與UPP中各種重要組分的定位關(guān)系。結(jié)果顯示，在IBDV感染細(xì)胞內(nèi)，泛素蛋白或泛素化的蛋白經(jīng)MG132處理后被檢測到在細(xì)胞質(zhì)中呈散點狀分布；IBDV的5種病毒蛋白中，只有VP3蛋白與泛素蛋白以及一種E2蛋白UBC9在細(xì)胞中呈現(xiàn)共定位現(xiàn)象。同時采用免疫共沉淀的方法驗證了上述蛋白之間的相互作用。另外，VP3真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中上述蛋白之間也存在共定位關(guān)系，進(jìn)一步確定了宿主

4、UPP利用UBC9對病毒VP3蛋白的靶向選擇作用。
　　 2.IBDV感染對宿主UPP相關(guān)組分轉(zhuǎn)錄本的調(diào)節(jié) IBDV感染DF-1后，應(yīng)用熒光定量RT-PCR技術(shù)分析感染后宿主UPP中27個相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的變化。分析顯示，IBDV感染引起了UB、UBI、E1、UBC9、UCHL5、PSMA2、PSMB7、PSMC1、PSMC5、PSMD2、PSMD5、PSME3和PSMF1十三個基因的上調(diào)，同時CHIP、HIP2、UCHL1和PS

5、ME4四個基因的下調(diào)，PSMA6和PSMB1在病毒感染前后沒有顯著變化；與UPP相關(guān)的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路NF-κB和caspase通路中p65、p105、IκB、Casp3、Casp8和Casp9六個關(guān)鍵基因以及MHC抗原遞呈途徑中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ兩個組分都在病毒感染后不同時間點被上調(diào)。隨后，比較研究表明DF-1傳代細(xì)胞和CEF原代細(xì)胞在響應(yīng)病毒感染過程中的轉(zhuǎn)錄本變化趨勢基本保持一致。采用不同毒力的IBDV進(jìn)行比較感染可知，強

6、毒和弱毒IBDV感染引起的UPP轉(zhuǎn)錄本的變化趨勢基本一致，只是在不同時間點調(diào)控的幅度略有不同，說明進(jìn)化上相關(guān)的病毒誘導(dǎo)了同一種特異的宿主UPP的響應(yīng)模式。進(jìn)一步利用病毒體內(nèi)感染的靶器官也揭示了一種比體外模型上變化更加溫和的響應(yīng)模式，即一些在體外模型上變化顯著的基因如E1、UBC9、PSMB7，PSMC5，PSME3等基因，在體內(nèi)反而沒有發(fā)生顯著變化。另外，通過將表達(dá)VP1、VP2、VP3、VP4和VP5的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞并研

7、究UPP轉(zhuǎn)錄本的變化，揭示了IBDV感染對宿主DF-1細(xì)胞中UPP轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控雖然并不是由于某一個基因單獨引起的，但是VP3可能在其中起著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用。
　　 3.IBDV感染對宿主UPP相關(guān)組分蛋白水平的調(diào)節(jié)通過制備的全套抗UPP蛋白的兔多抗，對IBDV感染細(xì)胞中UPP各蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UPP中的E1、UBC9及CHIP在病毒感染后的表達(dá)量均有所增加；去泛素化酶UCHL1在感染后至24h表達(dá)量最大，此后表

8、達(dá)量有所下降，72h基本不表達(dá)，96h和120h又恢復(fù)表達(dá)；UCHL5在感染末期才表達(dá)；Caspase途徑和MHC途徑中的主要組分的表達(dá)量均出現(xiàn)增加，多數(shù)在感染末期120h達(dá)到最大表達(dá)量。NF-κB途徑中組分在感染前期上調(diào)，48h之后基本不表達(dá)。同時利用以上多抗對IBDV感染細(xì)胞中UPP三種酶蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒感染引起了E1和UBC9點狀信號的縮小，以及彌散的團塊狀信號的出現(xiàn)；對CHIP在細(xì)胞內(nèi)的分布和結(jié)構(gòu)特征基本沒有影

9、響，但是陽性信號的細(xì)胞比例嚴(yán)重下降。同時，將表達(dá)VP3的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞并研究了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中UPP各組成蛋白的表達(dá)量的變化后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中UPP中的E1、UBC9、CHIP及去泛素化酶UCHL1和UCHL5在轉(zhuǎn)染細(xì)胞不同生長階段表達(dá)量上下波動，沒有明顯規(guī)律，這提示VP3對宿主DF-1細(xì)胞中UPP的調(diào)控作用可能主要集中在轉(zhuǎn)錄水平，在蛋白水平的調(diào)控可能更多地依賴于多個因子的共同作用。在分析IBDV感染對宿主蛋白酶體水解活性的影響

10、時發(fā)現(xiàn)，IBDV感染不引起DF-1細(xì)胞中蛋白酶體活性的顯著變化，而蛋白酶體抑制劑MG132無論持續(xù)作用還是僅作用一段時間都可以顯著地降低蛋白酶體的活性。
　　 4.阻斷宿主UPP對IBDV感染的影響利用特異性的蛋白酶體抑制劑MG132抑制宿主UPP的降解活性后發(fā)現(xiàn)，病毒感染48h以內(nèi)病毒基因的復(fù)制受到嚴(yán)重抑制，但是從48h開始抑制作用逐漸減弱，到96-120h，病毒逐漸恢復(fù)基因復(fù)制能力；從蛋白表達(dá)水平來看，感染后24-72h V