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文檔簡介
1、泛素-蛋白酶體途徑被認為是在哺乳動物細胞中選擇性的降解短壽命蛋白的主要系統(tǒng)。受調(diào)節(jié)蛋白主要與細胞周期進程、應激反應、抗原呈遞、信號傳導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復、凋亡、細胞器官的生物發(fā)生有關(guān)。泛素化是一系列酶級聯(lián)傳遞泛素的結(jié)果。具體過程為,泛素激活酶E1催化泛素與底物蛋白結(jié)合,即以ATP依賴的方式通過硫醇酯鍵將泛素的C-端硫醇基與自身的半胱氨酸結(jié)合,然后將活化的泛素傳遞給泛素結(jié)合酶E2;泛素連接酶E3將結(jié)合著泛素的泛素結(jié)合酶和底物蛋白連
2、接,從而促進泛素的羧基末端的甘氨酸與底物蛋白內(nèi)部的賴氨酸ε的氨基之間形成異肽鍵,泛素與蛋白結(jié)合;部分底物蛋白尚需要多聚泛素化聚集因子E4參與多聚泛素鏈的形成。之后,泛素多聚鏈的蛋白分子被26S蛋白酶復合體識別和降解,泛素-C-末端水解酶或者異肽酶酶解釋放泛素分子。 UbcH8是人的泛素結(jié)合酶基因UBE2L6編碼的蛋白,屬于主要包含Ubc結(jié)構(gòu)域的第一類泛素結(jié)合酶家族(ClassIE2s)成員。第一類泛素結(jié)合酶家族分子不能將泛素分
3、子直接傳遞給底物蛋白,提示這類E2需要借助泛素連接酶E3進行底物蛋白的識別。研究表明:UbcH8可以與RINGfinger或者BRmotif-containingdomain(inbetweenRINGfingers)以及HECT[6]等結(jié)構(gòu)域的蛋白發(fā)生相互4作用。該酶已被證明可以在E6/E6AP促進p53的泛素化中起作用。另外UbcH8作為泛素連接酶還可以促進一種泛素樣分子ISG15的傳遞。 核基質(zhì)蛋白MINT(Msx2-i
4、nteractingnucleartargetprotein)是1999年Newberry等在研究與同源盒轉(zhuǎn)錄抑制因子Msx2相互作用的蛋白時,發(fā)現(xiàn)的一個與Msx2共同參與顱面骨與神經(jīng)的發(fā)育的新的腳手架蛋白。與此同時,日本京都大學的T.Honjo研究組在利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選可以與RBP-J相互作用的新蛋白時,也篩選到了MINT分子(未報道)。MINT的轉(zhuǎn)錄物廣泛分布于各個組織。近年來的對MINT功能上的研究主要集中于:神經(jīng)發(fā)育、軟骨和
5、成骨,淋巴系統(tǒng)發(fā)育上。 MINT屬于Spen蛋白家族。SPEN蛋白家族成員具有的共同特點是:含有多個RNA識別基序(RNArecognitionmotif,RRM)和一個保守的C-端的SPOC結(jié)構(gòu)域[。SPOC結(jié)構(gòu)域可以募集共抑制復合物SMRT/N-CoR從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用。MINT可在許多不同的信號途徑中調(diào)節(jié)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄效應分子表達。Kuroda等和Oswald等發(fā)現(xiàn)MINT與Notch信號途徑的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子RBP-J相互
6、作用,并可能通過與Notch受體胞漿區(qū)競爭結(jié)合RBP-J結(jié)合位點從而抑制Notch信號途徑。Towler等研究認為:MINT具有增強Runx2募集于成纖維生長因子反應元件(OCFRE)的活性。最近我們研究組的研究表明:MINT也可以參與αA-晶狀體球蛋白結(jié)合蛋白1介導的Col2a1基因的轉(zhuǎn)錄抑制。 MINT在人類中的同源物SHARP是以HDAC共抑制復合物的新組份的形式發(fā)現(xiàn)的。進一步的研究發(fā)現(xiàn),HDAC的抑制劑TSA可以抑制M
7、INT/SHARP所介導的轉(zhuǎn)錄抑制作用,這些說明MINT/SHARP的轉(zhuǎn)錄抑制作用是HDAC依賴性的。Towler等研究表明MINT可以作為作為核基質(zhì)的平臺組織和整合骨鈣素基因5的轉(zhuǎn)錄反應;最近,F(xiàn)ranzOswald等研究SHARP/MINT的轉(zhuǎn)錄機制時發(fā)現(xiàn):一個包括CtIP/CtBP的抑制復合體可以促進RBP-J/SHARP-介導的Notch靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制。總之,MINT可以通過蛋白-蛋白相互作用,募集HDAC或者CtIP和CtB
8、P等方式調(diào)節(jié)許多包括Msx2,RBP-J,核受體,AlphaA-CRYBP1等轉(zhuǎn)錄因子介導的轉(zhuǎn)錄;另外在核基質(zhì)中,MINT可以作為腳手架蛋白的平臺組織和整合多個調(diào)控信號。MINT作為位于細胞核內(nèi)的大分子腳手架蛋白,廣泛分布于各個組織,其功能是復雜的,轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制也是多樣的。對這兩方面的研究還存在許多空白點。 為了進一步深刻理解MINT的功能和介導轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制,我們首先使用了酵母雙雜交的方法,對MINT蛋白進行了相關(guān)蛋白的篩
9、選。其中在對其C末端區(qū)域的篩選中,使用人的淋巴結(jié)的cDNA文庫我們篩選到了一個編碼人泛素結(jié)合酶UbcH8的UBE2L6基因。進而使用不同的MINT的截短體,利用酵母雙雜交的方法再次對MINT與UbcH8相互作用的區(qū)域進行了初步定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MINT的SPOC結(jié)構(gòu)域介導它與UbcH8之間的相互作用,該區(qū)域已經(jīng)被認為是介導MINT與其他分子相互作用的界面。之后,我們又使用了一系列的生物化學的方法(GSTpull-downassay、哺乳動物
10、細胞內(nèi)雙雜交及免疫共沉淀實驗)對MINT與UbcH8之間的體外和體內(nèi)相互作用進行了深入驗證,確證它們之間存在物理上的相互作用。最后;利用報告基因?qū)嶒炞C實MINT與UbcH8之間相互作用的生理意義。結(jié)果顯示:MINT抑制RBP-J介導的轉(zhuǎn)錄對于泛素-蛋白酶體途徑的抑制劑MG132是敏感的。低劑量的MINT可以抑制Notch受體胞內(nèi)段(Notchintracellulardomain,NICD)激活Notch信號途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RBP-J
11、調(diào)控的報告基因的活性,并且UbcH8可以增強MINT發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制。因此我們初步得出結(jié)論:MINT介導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可以至少部分依賴于UbcH86所在的泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitinproteasomesystem,UPS)的調(diào)節(jié)。 此外,在確定UPS調(diào)節(jié)MINT調(diào)控的底物蛋白時,我們使用不同于NICD的激活物:EBNA2和VP16激活的RBP-J調(diào)節(jié)的報告基因系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):加入UbcH8后,并不能增強MINT抑制EBNA
12、2和VP16激活的RBP-J介導的轉(zhuǎn)錄活性,所以排除了RBP-J是UbcH8和MINT介導的泛素化底物。新的底物蛋白的篩選是先理論假設(shè)某底物蛋白可以被UPS泛素化后而被降解,并且該底物蛋白與MINT和UbcH8關(guān)聯(lián)。在MINT相關(guān)的Notch信號途徑中,NICD分子可以被泛素化,并可通過UPS降解[20]。那么MINT能否與NICD相互作用,并將泛素分子傳遞給NICD?我們首先使用酵母雙雜交來驗證上述假設(shè)的理論。通過酵母雙雜交,我們初步
13、得出:MINT的-N末端可以與NICD相互作用,符合了理論假設(shè)的前提條件。然而MINT是否在與UbcH8的相互作用中扮演泛素連接酶的作用向底物傳遞泛素分子?或者兩者之間的相互作用可以介導MINT的泛素化修飾,或者MINT是以E2/E3泛素化復合體的形式扮演腳手架的結(jié)構(gòu)平臺作用?其底物蛋白是什么?NICD?與MINT相關(guān)的已經(jīng)被證明可以被泛素化的Runx2?亦或是其他蛋白呢?這些問題仍需要進一步的深入研究??傊?,本文提供的結(jié)果可能提示一種
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