溶酶體途徑與蛋白酶體途徑降解α-synuclein蛋白的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分: 目的: 探討溶酶體和蛋白酶體功能障礙在帕金森病發(fā)病中的作用機制。 方法: 用神經(jīng)生長因子（Nerve growth factor，NGF）誘導(dǎo)分化PC12細胞作為研究多巴胺能神經(jīng)元的細胞載體，分別及聯(lián)合應(yīng)用溶酶體抑制劑和蛋白酶體抑制劑 lactacystin、E64(Trans-Epoxysuccinyl -L-leucylam)處理神經(jīng)元樣分化的PC12細胞，四甲基偶氮唑鹽(MTT) 法檢測細胞活性及代謝狀

2、態(tài)、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，免疫熒光雙標(biāo)方法觀察PC12細胞內(nèi)硫黃素S、a-synuclein蛋白陽性聚集包涵體的形成；Hoechst33258觀察a-synuclein蛋白、硫黃素S雙標(biāo)陽性細胞的凋亡。 結(jié)果: 應(yīng)用上述抑制劑后細胞活性下降(呈濃度依賴性)而細胞凋亡率上升；藥物處理后出現(xiàn)a-synuclein蛋白聚集和包涵體形成的PC12細胞百分比為：E64組7.94±0.97％，lactacystin組20.33±2.4％

3、，合用組36.77±3.5％，與對照組及各組之間相比差異均有顯著性（P<0.05）；a-synuclein蛋白陽性包涵體細胞存在明顯凋亡（17.29±1.54％）。 結(jié)論: 溶酶體和蛋白酶體功能障礙通過誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)元細胞內(nèi)a-synuclein蛋白異常聚集可能在PD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。 第二部分: 目的: 探討a-synuclein蛋白細胞內(nèi)溶酶體途徑降解方式及其聚集機制。 方法: 用神經(jīng)生長因子N

4、GF誘導(dǎo)分化PC12細胞作為研究多巴胺能神經(jīng)元的細胞載體，應(yīng)用魚藤酮處理PC12細胞建立a-synuclein蛋白細胞模型。用LAMP2抗體標(biāo)記溶酶體膜，用免疫熒光雙標(biāo)明確a-synuclein蛋白和LAMP2之間的共定位。使用溶酶體途徑降解抑制劑E64，3-MA,BafA1 處理神經(jīng)元樣分化的PC12細胞，應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)方法觀察PC12細胞內(nèi)硫黃素S、a-synuclein蛋白陽性聚集包涵體形成情況。比較各組的差異。 結(jié)果:

5、 a-synuclein蛋白在溶酶體中出現(xiàn)，用E64處理魚藤酮預(yù)處理過的PC12細胞后a-synuclein蛋白聚集且較多包涵體形成15.36±0.85％，與對照組、3-MA組和BafA1組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3-MA,BafA1處理魚藤酮預(yù)處理過的PC12細胞后a-synuclein蛋白聚集較少且僅有少量包涵體形成(7.65±0.46％、8.72±0.39％),與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論: