睪丸蛋白酶體的鑒定及其功能研究.pdf

1、真核生物26S蛋白酶體由兩部分構(gòu)成，負(fù)責(zé)催化底物降解的20S催化顆粒和連接在20S兩個末端的19S調(diào)節(jié)顆粒，其中20S催化顆粒是由四個環(huán)狀結(jié)構(gòu)疊合在一起形成的對稱的桶狀結(jié)構(gòu)（αββα），由于其內(nèi)表面PSMB5、PSMB7和PSMB6三個亞基的存在，兩個β環(huán)具有chymotrypsin-like、trypsin-like和caspase-like三種催化活性。在IFN-γ的誘導(dǎo)下，這三個亞基可被PSMB8、PSMB10和PSMB9替換，成

2、為可增強(qiáng)抗原遞呈作用的免疫蛋白酶體的一部分。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示家兔睪丸中除含有普通的26S蛋白酶體外，還可能存在兩種不同類型的蛋白酶體。它們包含功能未知的蛋白酶體激活因子PSME4，其20S催化顆粒還存在著不同的亞基（比如，尚未見報(bào)道的PSMA7-like亞基和存在于免疫蛋白酶體的的亞基）。我們在純化牛肌肉、睪丸和脾臟中的蛋白酶體時發(fā)現(xiàn)，從這三種組織來源的蛋白酶體在從陰離子交換柱上洗脫的時候所需的離子強(qiáng)度不同。利用

3、短肽熒光底物對我們從牛肌肉、睪丸和脾臟中純化的26S蛋白酶體進(jìn)行酶活性分析的時候發(fā)現(xiàn)，我們初步發(fā)現(xiàn)，從牛睪丸中純化出的蛋白酶體的chymotrypsinlike活性要顯著低于從牛肌肉和脾臟中純化出的蛋白酶體的活性（P<0.05），睪丸蛋白酶體的trypsinlike活性顯著高于肌肉和脾臟中的蛋白酶體的活性（P<0.05），而肌肉蛋白酶體的caspaselike活性要顯著高于睪丸和脾臟蛋白酶體的活性（P<0.05）。但是應(yīng)用兩種蛋白質(zhì)底物

4、HistoneH1和Casein來測定這三種組織來源的蛋白酶體的降解活性卻未發(fā)現(xiàn)存在著何種差異（P>0.05）。在應(yīng)用針對蛋白酶體三種活性位點(diǎn)的抑制劑（MG132、Velcade、Leupeptin和Ac-ApnLD-Al）對肌肉和睪丸組織來源的蛋白酶體進(jìn)行活性抑制時也未發(fā)現(xiàn)對這兩種蛋白酶體的抑制效應(yīng)存在差異（P>0.05）。
　　 在應(yīng)用體外培養(yǎng)的生精細(xì)胞系和體細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)和Westernblot實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，在

5、所選的細(xì)胞系中都存在著表達(dá)水平類似的PSMB5基因，但是在培養(yǎng)的精原細(xì)胞株和精母細(xì)胞株（GC-lspg和GC-2spd）中存在著較高水平的PSMB8基因的表達(dá)，而在其他兩種體細(xì)胞株（NIH3T3和C2C12）中卻并未發(fā)現(xiàn)這種基因的表達(dá)。應(yīng)用PSME4的抗體在精母細(xì)胞系GC-2spd中進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)來確認(rèn)同PSME4結(jié)合的20S蛋白酶體類型時我們發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體的催化亞基中PSMB8、PSMB9、PSMB6和PSMB7都可以同PSME4共

6、沉淀下來，而蛋白酶體的組成亞基PSMB5和在IFN-γ誘導(dǎo)下產(chǎn)生的亞基PSMB10都不能同PSME4共沉淀，提示由這兩種催化亞基參與所構(gòu)成的20S蛋白酶體可能不與PSME4發(fā)生結(jié)合。而應(yīng)用PSME4的抗體在體細(xì)胞系NIH3T3中進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)時卻并未沉淀下來蛋白酶體的催化亞基，提示在體細(xì)胞中雖然也存在著PSME4的表達(dá)，但是可能并不參與組成蛋白酶體。
　　 應(yīng)用原位雜交技術(shù)觀察了小鼠睪丸組織切片中PSME4、PSMB8和PSM

7、B5在生精細(xì)胞不同發(fā)育階段中的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)PSME4、PSMB8和PSMB5的基因表達(dá)水平隨生精細(xì)胞處于不同的發(fā)育階段而存在著差異，以生精細(xì)胞發(fā)生周期中的Ⅷ期為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，在此期之前，PSME4、PSMB8和PSMB5在圓形精子中的表達(dá)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，而粗線期精母細(xì)胞（Pachytenespermatocyte）中的表達(dá)為陰性反應(yīng)；Ⅷ期之后，這三種基因在粗線期精母細(xì)胞中的表達(dá)轉(zhuǎn)為陽性反應(yīng)，而在圓形精子和細(xì)線期精母細(xì)胞（Leptotenesp

8、ermatocyte）中的表達(dá)為陰性，此外這三種基因在各期的Sertoli細(xì)胞和長形精子細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。此外應(yīng)用PSMB8和PSMB5的抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)時我們初步發(fā)現(xiàn)，PSMB5在一些間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)存在著高水平的表達(dá)，PSMB8在睪丸組織內(nèi)的各種細(xì)胞中均有表達(dá)，在生精細(xì)胞的細(xì)胞核中均未發(fā)現(xiàn)有PSMB5的表達(dá)，除了長形精子細(xì)胞的細(xì)胞核，PSMB8在各生精細(xì)胞核中均發(fā)現(xiàn)存在著表達(dá)。
　　 這些結(jié)果提示在睪丸內(nèi)精子細(xì)胞發(fā)

9、生的不同時期及其不同的細(xì)胞器內(nèi)，蛋白酶體的亞基組成模式可能存在著差別，這可能同精子細(xì)胞在發(fā)育的不同時期所經(jīng)歷的細(xì)胞事件有一定的關(guān)系。
　　 真核細(xì)胞內(nèi)即將被26S蛋白酶體降解的蛋白質(zhì)底物一般都攜帶有一個泛素標(biāo)簽，這個泛素標(biāo)簽是通過一系列的酶促反應(yīng)--泛素化反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的，參與這一系列反應(yīng)的酶分別被命名為E1、E2和E3。E1是泛素激活酶（Ubiquitin-activatingenzyme），可以利用ATP降解所產(chǎn)生的能量激活泛素

10、以形成高能的硫脂鍵，接著激活的泛素分子可以被轉(zhuǎn)移到E2泛素載體蛋白（Ubiquitincarrierprotein），最后在E3泛素連接酶（Ubiquitinligases）的協(xié)同作用下，將多聚泛素鏈轉(zhuǎn)移到底物分子上，之后這種“標(biāo)記”的蛋白質(zhì)底物分子可以為26S的蛋白酶體所識別并繼而被降解。
　　 研究表明一些參與細(xì)胞凋亡途徑的蛋白質(zhì)在果蠅精子細(xì)胞的發(fā)育階段發(fā)揮著非常重要的作用。同時具有泛素載體蛋白（E2）和泛素連接酶（E3）活

11、性的巨型凋亡抑制蛋白（InhibitorofApoptosisProtein）BRUCE/Apollon被證明可以保護(hù)精子細(xì)胞核免于過度的濃縮和退化，因此推測其在生精過程中可能具有非常重要的功能。最新研究表明，BRUCE還控制有絲分裂后子細(xì)胞的最終分離。由于BRUCE蛋白是泛素連接酶Nrdp1/RNF41的底物，我們觀察了Nrdp1/RNF41蛋白及BRUCE蛋白的表達(dá)水平同細(xì)胞周期進(jìn)行的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Nrdp1/RNF41蛋白的表達(dá)水平隨

12、細(xì)胞周期的變化而變化，其表達(dá)水平在G2期早期（同步化釋放后3-6小時間）出現(xiàn)升高，在同步化釋放后18-24小時間升至最高。而BRUCE蛋白的表達(dá)水平同Nrdp1蛋白的表達(dá)水平較為類似，但似乎落后于Nrdp1蛋白水平的變化，在G2期（同步化釋放后6小時）開始出現(xiàn)升高，之后表達(dá)水平一直處于升高狀態(tài)，在同步化釋放的早期，細(xì)胞處于S期時表達(dá)水平最低。這些結(jié)果表明，Nrdp1可能通過控制BRUCE的泛素化和降解而參與細(xì)胞周期的調(diào)控。這兩種蛋白質(zhì)在