泛素—蛋白酶體通路在生精過程中的作用.pdf

1、本論文包括兩部分：第一部分工作包括蛋白酶體激活因子PA200原核表達(dá)載體的構(gòu)建，及PA200在生精過程中功能的初步探索；第二部分工作主要進(jìn)行了新的蛋白酶體亞單位hRpn13的蛋白純化。 精子發(fā)生是一個(gè)高度有序的過程，在這一過程中蛋白質(zhì)成分和水平均發(fā)生顯著改變，而泛素—蛋白酶體通路在其中發(fā)揮重要調(diào)控作用。該通路是一種高效的、有選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑，在細(xì)胞周期調(diào)控、抗原提呈、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等各方面發(fā)揮作用。真核細(xì)胞26S蛋白酶體包括20

2、S核心催化亞單位和19S調(diào)節(jié)亞單位。其它已知的調(diào)節(jié)亞單位還有PA28和PA200，其中PA200是最新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)。 PA200基因又名PSME4，其在哺乳動(dòng)物中高度保守。Rechsteiner等人從牛睪丸中純化得到PA200，并制備了其抗體。用此抗體進(jìn)行的Western檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PA200有三種形式，其分子量大小分別為200kDa、160kDa和60kDa。它們廣泛分布于小鼠各組織中，其中200kDa蛋白在睪丸中含量最高。目前對(duì)P

3、A200生物學(xué)功能的研究證實(shí)其為20S的激活因子，但它是否在DNA修復(fù)中發(fā)揮作用還存在爭(zhēng)議。此外S1eckman等人通過基因敲除的方法得到了PA200△/△小鼠，除雄性生殖能力顯著下降外，無其它顯著異常；對(duì)睪丸和附睪的組織切片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)生精過程中減數(shù)分裂的精母細(xì)胞存在形態(tài)異常，同時(shí)減數(shù)分裂后單倍體精子細(xì)胞成熟存在障礙。 實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了PA200的200kDa和60kDa兩種原核表達(dá)載體，并嘗試對(duì)其進(jìn)行表達(dá)。同時(shí)還用BLAST和

4、外顯子預(yù)測(cè)的方法對(duì)已知剪接體進(jìn)行了分析，結(jié)果提示已知的PA200全長(zhǎng)可能并不完全，以人睪丸cDNA文庫為模板進(jìn)行的擴(kuò)增證實(shí)了上述預(yù)測(cè)。此外還用RNA干擾和免疫熒光的方法初步研究了PA200在生精過程中的作用。其中，RNA干擾質(zhì)粒已構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染小鼠精原干細(xì)胞和精母細(xì)胞的工作正在進(jìn)行中。而對(duì)小鼠睪丸、附睪冰凍切片進(jìn)行的免疫熒光結(jié)果提示PA200同時(shí)存在于體細(xì)胞和生精細(xì)胞的細(xì)胞核中，特別是其在圓形精子細(xì)胞和成熟精子中的高表達(dá)值得關(guān)注。

5、 同時(shí)，泛素—蛋白酶體通路中泛素化與去泛素化對(duì)于維持生物體內(nèi)蛋白質(zhì)功能也起著至關(guān)重要的作用，第二部分工作研究對(duì)象hRpn13就在去泛素化中發(fā)揮功能。該部分在本組邱小波教授的前期工作基礎(chǔ)上開展。在親和層析法純化蛋白酶體的過程中，他發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的407個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，因其N端與酵母Daq1/Rpn13有27.6％的同源性，故將其命名為hRpn13。其在真核生物中高度保守，并在小鼠各組織中廣泛表達(dá)。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hRpn13存在于蛋白酶