蛋白酶體抑制劑對(duì)中腦腦片的毒性作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 體外大鼠器官型中腦腦片培養(yǎng)模型的建立 目的：建立體外大鼠長(zhǎng)期器官型中腦腦片培養(yǎng)模型，為下一步藥物干預(yù)研究作準(zhǔn)備。 方法：采用液氣雙相界面培養(yǎng)法，取出生10-28天的Wistar大鼠中腦切片應(yīng)用Millicell微孔膜培養(yǎng)插件培養(yǎng)10-30天，培養(yǎng)過程中通過鏡下觀察及測(cè)定LDH釋放量來檢測(cè)中腦腦片活性，HE及TH免疫組織化學(xué)染色觀察腦片細(xì)胞狀態(tài)。 結(jié)果：鏡下觀察腦片培養(yǎng)10-21天內(nèi)能正常生長(zhǎng)，21天以

2、后腦片活性下降并逐漸死亡；LDH檢測(cè)結(jié)果顯示5-7天后腦片培養(yǎng)趨于穩(wěn)定；HE及TH免疫組織化學(xué)染色顯示腦片結(jié)構(gòu)清晰，黑質(zhì)細(xì)胞顯示良好。 結(jié)論：7-21天內(nèi)腦片生長(zhǎng)良好，成功建立了體外大鼠長(zhǎng)期器官型中腦腦片培養(yǎng)模型。 第二部分蛋白酶體抑制劑對(duì)中腦腦片的毒性作用及其機(jī)制研究 目的：利用已建立的中腦腦片培養(yǎng)模型觀察蛋白酶體抑制劑Lactacystin對(duì)腦片及黑質(zhì)細(xì)胞的毒性作用并初步探討其機(jī)制。 方法：對(duì)穩(wěn)定培養(yǎng)

3、并生長(zhǎng)良好的腦片分組，分別加入Lactacystin0.1μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L作用24小時(shí)，測(cè)定培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶（LDH）活力水平，TH免疫組化觀察黑質(zhì)細(xì)胞變性缺失，α-synuclein免疫組化檢測(cè)腦片α-synuclein表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)黑質(zhì)細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：經(jīng)蛋白酶體抑制劑Lactacystin處理后，腦片活性下降；與對(duì)照組比較腦片黑質(zhì)部位TH陽性神經(jīng)元數(shù)量減少（

4、P<0.05），α-synuclein表達(dá)增加（P<0.05），0.5μmol/L、1.0μmol/L和5.0μmol/L的 Lactacystin處理組TUNEL染色陽性率明顯增加（P<0.05）。 結(jié)論：蛋白酶體抑制劑Lactacystin對(duì)腦片具有特異性毒性作用，導(dǎo)致黑質(zhì)部位DA能神經(jīng)細(xì)胞缺失，誘導(dǎo)黑質(zhì)細(xì)胞凋亡，其作用具有濃度依賴性。其機(jī)制可能與增加α-Synuclein的異常聚集有關(guān)。蛋白酶體功能缺陷在帕金森病發(fā)病機(jī)制中