組織特異性蛋白酶體抑制劑—藤黃酸的發(fā)現(xiàn)及意義.pdf

1、真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解途徑主要有兩條：一是溶酶體途徑，主要降解膜蛋白和長壽命的蛋白質(zhì)等。二是泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasome system, UPS），此系統(tǒng)介導(dǎo)了細胞內(nèi)80％以上蛋白質(zhì)的降解，包括異常蛋白質(zhì)和短壽命的蛋白質(zhì)等。UPS參與了細胞生命的調(diào)節(jié)過程，如細胞周期、細胞凋亡、基因表達、炎癥、免疫調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)質(zhì)量控制等。研究表明，在許多疾病中，尤其是惡性腫瘤，都發(fā)現(xiàn)有蛋白酶體活性的異常改變。因此，在臨床應(yīng)

2、用方面，蛋白酶體抑制劑成為抗腫瘤治療的重要手段之一。萬珂（Velcade，Vel），是首個被美國 FDA批準用于臨床上治療多發(fā)性骨髓瘤的蛋白酶體抑制劑，并取得了良好的療效。但是，一方面，由于復(fù)發(fā)、耐藥的出現(xiàn)；另一方面，由于它的毒副作用，如周圍神經(jīng)病變，血小板低下，胃腸道刺激，乏力以及抑制造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，使得Vel的應(yīng)用受到了限制。由于蛋白酶體存在于機體的各類細胞中，非選擇性的蛋白酶體抑制劑對體內(nèi)細胞的蛋白酶體功能均有一定程度的抑制效

3、應(yīng)，由此對機體產(chǎn)生嚴重的毒副作用。因此，我們的研究主要從尋找特異性抑制腫瘤細胞蛋白酶體活性的抑制劑，以降低對機體的毒副作用來解決這一問題。在藥物篩選的過程中，我們注意到了藤黃酸（Gambogic acid，GA），一個從藤黃樹脂中提取的天然化合物。研究表明， GA具有顯著的體內(nèi)、外抗腫瘤效應(yīng)，而且副作用很小，尤其對免疫和造血系統(tǒng)的毒性很小，已經(jīng)被中國的FDA批準用于治療不同腫瘤的Ⅲ期臨床試驗。盡管有研究報道， GA抗腫瘤作用的機制可能與

4、抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，抑制NF-κB信號通路，抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）有關(guān)，但是GA抗腫瘤效應(yīng)的具體機制還未完全明了。因此，明確GA抗腫瘤作用的靶點將具有重要的意義。本課題就GA的作用機制展開了具體的探討，進行了如下實驗：
　?、臛A間接抑制蛋白酶體的活性。實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn)，GA可以與經(jīng)典蛋白酶體抑制劑Mg132或Mg262聯(lián)合增敏抑制腫瘤細胞的生長以及誘導(dǎo)腫瘤細胞的死亡。為了進一步探討這一聯(lián)合作用的機制，我

5、們通過對泛素化蛋白質(zhì)的檢測，發(fā)現(xiàn) GA不僅可以明顯的增強蛋白酶體抑制劑Mg132或Mg262引起的泛素化蛋白質(zhì)的聚集；同時，GA本身也可以劑量依賴性的誘導(dǎo)泛素化蛋白質(zhì)以及26S蛋白酶體特異性外源性底物-GFPu的聚集增加。但是，發(fā)現(xiàn)相同劑量的GA對純化的20S蛋白酶體糜蛋白酶樣（Chymotrypsin-like，CT-like）活性沒有影響，只有當(dāng)GA的濃度高達5μΜ以上時才有部分抑制效應(yīng)，IC50高達25μΜ左右。從以上結(jié)果我們推測

6、，GA本身不是一個直接的蛋白酶體抑制劑。
　?、朴嬎銠C模擬預(yù)測GA的代謝產(chǎn)物MT1潛在的與20S蛋白酶體β5亞基結(jié)合。由于GA在細胞上可以顯著的抑制細胞的CT-like活性，而對純化的蛋白酶體活性抑制效應(yīng)較弱，由此我們推測GA是一個前體藥物，它在細胞上所表現(xiàn)的蛋白酶體抑制功能可能是由它的某個或某些代謝產(chǎn)物所產(chǎn)生的。接下來，我們應(yīng)用計算機模擬預(yù)測GA及其代謝產(chǎn)物MT1、MT2與20S蛋白酶體β5亞基的分子對接情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有GA的

7、代謝產(chǎn)物MT1可以和β5亞基結(jié)合，具有潛在抑制20S蛋白酶體CT-like活性的作用。
　?、荕T1和CYP2E1負責(zé)GA誘導(dǎo)的腫瘤細胞蛋白酶體活性的抑制。為了進一步證實 MT1的這一直接蛋白酶體抑制作用，我們應(yīng)用化學(xué)合成純化的MT1直接作用于純化的20S蛋白酶體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MT1對純化的20S蛋白酶體CT-like活性抑制的IC50約為0.5μΜ，與GA（IC50約為25μΜ）形成鮮明的對比。接著我們在多種腫瘤細胞系中發(fā)現(xiàn)了GA

8、主要經(jīng)過CYP2E1代謝產(chǎn)生MT1之后才具有明顯的蛋白酶體抑制作用，應(yīng)用CYP2E1的抑制劑二乙基二硫氨甲酸（DDC）或者CYP2E1-siRNA可以明顯逆轉(zhuǎn) GA介導(dǎo)的蛋白酶體活性的降低。此外，我們還在多種細胞系中檢測到CYP2E1的表達具有差異性。
　?、菺A選擇性抑制細胞蛋白酶體CT-like的活性。進一步在人肝癌細胞系HePG2上，發(fā)現(xiàn)DDC也可以部分逆轉(zhuǎn)GA誘導(dǎo)的HePG2細胞蛋白酶體活性的降低。此外，還發(fā)現(xiàn)在HePG2

9、細胞上，GA不抑制半胱天冬酶樣（Caspase-like）活性，只輕微抑制胰蛋白酶樣（Trypsin-like）活性。表明GA在細胞上是選擇性抑制CT-like活性的。
　?、蒅A與Vel基因表達譜相似。有研究報道，在許多腫瘤細胞系中，蛋白酶體抑制可以誘導(dǎo)典型的基因表達譜。接下來，我們的實驗應(yīng)用DNA芯片檢測基因表達譜的變化，發(fā)現(xiàn)GA不僅與Vel有相似的基因表達譜的改變，也產(chǎn)生了類似的蛋白酶體抑制特定基因。更進一步的確定了GA在細

10、胞上的蛋白酶體抑制作用。
　　⑹GA的細胞毒性依賴于其被CYP2E1代謝后所誘導(dǎo)的蛋白酶體活性的抑制。研究了GA在細胞上產(chǎn)生的蛋白酶體抑制效應(yīng)是否決定它的細胞毒性作用。我們發(fā)現(xiàn)CYP2E1的抑制劑DDC明顯逆轉(zhuǎn)GA引起的蛋白酶體活性的下降之后，也明顯的逆轉(zhuǎn)了GA誘導(dǎo)的細胞死亡。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用 CYP1A2的抑制劑α-萘黃酮（ANF）則可以明顯增加GA介導(dǎo)的泛素化蛋白質(zhì)的聚集，進而明顯的增強GA誘導(dǎo)的細胞死亡。
　　⑺

11、下調(diào)CYP2E1逆轉(zhuǎn)而下調(diào)CYP1A2則增強GA誘導(dǎo)的細胞死亡。為了進一步證實GA誘導(dǎo)的細胞死亡取決于它被CYP2E1代謝之后產(chǎn)生的效應(yīng)，我們應(yīng)用siRNA的方法分別將CYP2E1和CYP1A2的表達下調(diào)。我們觀察到了與蛋白酶體抑制相類似的結(jié)果，抑制CYP2E1可以明顯逆轉(zhuǎn)而抑制CYP1A2則明顯增強GA誘導(dǎo)的細胞死亡。這些結(jié)果表明，GA誘導(dǎo)的細胞毒性作用依賴于其被 CYP2E1代謝生成MT1后所具有的蛋白酶體活性的抑制功能。
　

12、?、淘诙喟l(fā)性骨髓瘤細胞中，GA誘導(dǎo)的蛋白酶體活性抑制及細胞毒性作用也可以被DDC逆轉(zhuǎn)。由于蛋白酶體抑制劑最初被批準用于臨床是用來治療多發(fā)性骨髓瘤疾病的，并且取得了良好的療效。因此，接下來我們在多發(fā)性骨髓瘤細胞系NCI-H929和U266上探討GA是否也具有顯著的蛋白酶體抑制及細胞毒性效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，在多發(fā)性骨髓瘤細胞上，GA也可以明顯誘導(dǎo)蛋白酶體活性的抑制和細胞毒性作用，而且，這些效應(yīng)同樣可以被CYP2E1的抑制劑DDC所逆轉(zhuǎn)。

13、　　⑼GA誘導(dǎo)細胞毒性的機制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。為了進一步明了GA誘導(dǎo)細胞毒性效應(yīng)的作用機制，我們檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白的變化。發(fā)現(xiàn)GA可以劑量依賴性的引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的改變，而且0.75μΜ的GA與50 nM的Vel有著類似的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的變化。表明，GA與Vel類似，蛋白酶體抑制引起的細胞毒性作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。
　?、蜧A在體內(nèi)延長P388腹水瘤小鼠的生存、抑制H22實體瘤的生長及抑制蛋白酶體的功能。為

14、了進一步明確GA的效應(yīng)，接下來我們對GA的體內(nèi)抗腫瘤作用進行了研究。我們的實驗發(fā)現(xiàn)GA可以提高P388腹水瘤小鼠的生存，可以在體內(nèi)時間依賴性的抑制P388腹水瘤細胞的蛋白酶體活性，以及抑制H22實體瘤的生長。接著，我們發(fā)現(xiàn)，GA可以選擇性的抑制H22實體瘤的蛋白酶體功能，對肌肉組織沒有作用。而GA與Vel，兩者都可以抑制腫瘤細胞和肝臟組織的蛋白酶體功能，可以選擇性誘導(dǎo)腫瘤組織PARP蛋白的切割，但對肌肉組織沒有影響。我們還檢測了GA靜脈

15、注射小鼠后相關(guān)正常組織中的分布情況，結(jié)果顯示靜脈注射后，GA可在肝臟，脾臟以及肌肉組織中被檢測到。有研究報道，Vel靜脈注射小鼠后，有與GA類似的肝臟、脾臟分布。但是我們發(fā)現(xiàn)Vel可以明顯的引起脾臟組織泛素化蛋白質(zhì)的聚集增加，而GA沒有這一作用。表明與Vel相比，GA誘導(dǎo)的蛋白酶體抑制作用具有更好的組織選擇性。
　?、螱A的C9-C10位雙鍵被破壞后蛋白酶體抑制和細胞毒性作用明顯減弱。之前國內(nèi)、外的研究表明，GA產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的活

16、性位點是其 C9-C10位雙鍵。接下來，我們探討GA的C9-C10位雙鍵是否完整對GA功能的影響。我們發(fā)現(xiàn)GA的C9-C10位雙鍵被破壞后蛋白酶體抑制功能明顯減弱，繼而引起細胞毒性作用也明顯降低。因此GA誘導(dǎo)的細胞毒性效應(yīng)依賴其C9-C10位雙鍵的完整，而且GA的蛋白酶體抑制作用是其產(chǎn)生細胞毒性效應(yīng)的前提條件。
　　⑿在體外和體內(nèi)，GA均不降低CYP2E1缺乏的外周血淋巴細胞的生存。為了進一步研究CYP2E1在GA介導(dǎo)的蛋白酶體活

17、性的抑制及細胞毒性作用中的重要性，接下來，我們比較了GA與Vel對外周血細胞的影響情況。發(fā)現(xiàn)Vel可以明顯抑制正常小鼠和正常人外周血細胞的CT-like活性；明顯抑制正常人外周血淋巴細胞的生存；顯著降低正常小鼠外周血白細胞的數(shù)目。而無論在體內(nèi)還是體外，GA對CYP2E1缺乏的外周血細胞均沒有蛋白酶體抑制作用，以及不抑制這類細胞的生存。我們的實驗還在小鼠或人的骨髓細胞以及一些腫瘤細胞系中檢測了CYP2E1和CYP1A2的分布。發(fā)現(xiàn)與腫瘤細

18、胞相比，小鼠的骨髓細胞CYP1A2高表達，CYP2E1則低表達。在正常人骨髓細胞中，CYP1A2和CYP2E1都低表達，而這兩者在白血病病人的骨髓細胞中都高表達。表明在正常小鼠和人的骨髓中，都不能很好的代謝GA。
　?、雅c正常人細胞相比，GA對白血病病人的腫瘤細胞有著更顯著的細胞毒性和蛋白酶體抑制效應(yīng)。收集了多例臨床標本，更進一步比較了GA和Vel對白血病病人的腫瘤細胞或正常人外周血單個核細胞的影響。結(jié)果顯示，Vel對白血病病人的

19、腫瘤細胞和正常人外周血單個核細胞都產(chǎn)生明顯的蛋白酶體抑制和細胞毒性作用；而GA只對白血病病人的腫瘤細胞有著明顯的蛋白酶體抑制及細胞毒性效應(yīng)，但對正常人外周血細胞的作用比對腫瘤細胞的作用明顯減小。表明與Vel相比，GA可以更好的選擇性誘導(dǎo)白血病腫瘤細胞蛋白酶體活性的抑制以及細胞毒性作用。
　?、已芯勘砻鳎孩貵A是一個蛋白酶體抑制劑的前體藥物，必須經(jīng)過細胞內(nèi)的CYP2E1代謝之后才具有抑制蛋白酶體的功能；③GA的蛋白酶體抑制效應(yīng)是其產(chǎn)