蛋白酶體抑制劑聯(lián)合亞砷酸誘導NB4細胞凋亡機制的研究.pdf

1、目的：本實驗采用蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib，BOR)聯(lián)合亞砷酸(ArsenicTrioxide,ATO)動態(tài)觀察對人急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)細胞株NB4的凋亡和生長抑制作用，探討蛋白酶體抑制劑能否增加NB4細胞對亞砷酸的敏感性以及和亞砷酸能否協(xié)同誘導NB4細胞凋亡，為APL開拓新的治療方法，同時為BOR與ATO二者聯(lián)合應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。 方法

2、：將受試對象分為9組：正常對照組(D)；5 nmol/L BOR(Al)，10 nmol/L BOR(A2);0.5μmol/L ATO(B1)，1.0μmol/L ATO(B2)；5 nmol/L BOR+0.5μmol/L ATO(C1)，5 nmol/L BOR+1.0μmol/L ATO(C2)，10 nmol/L BOR+0.5μmol/L ATO(C3)，10 nmol/L BOR+1.0μmol/L ATO(C4)。作用時

3、間分為三個水平：24小時，48小時，72小時，檢測以下相關(guān)指標的變化： (1) 瑞氏-姬姆薩染色后高倍顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化； (2) 四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測藥物對細胞的生長抑制效應(yīng)； (3) 流式細胞儀檢測細胞凋亡率及進行細胞周期分析； (4) 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測抑凋亡基因survivin的表達變化情況。 結(jié)果： (1) 形態(tài)學的觀察：細胞凋亡時細胞外形迅

4、速皺縮，體積明顯減??；核皺縮，染色質(zhì)凝聚成致密團塊，隨之細胞核碎裂成小的圓形致密團塊，散布于胞質(zhì)中；晚期產(chǎn)生的細胞碎片呈簇狀分布于細胞周圍。5 nmol/L BOR與10 nmol/L BOR作用于NB4細胞后，光鏡下可觀察到細胞的凋亡，且隨著藥物濃度的增高，凋亡細胞的數(shù)量也增多。1μ mol/L ATO+10nmol/L BOR作用于NB4細胞24小時后可見核膜皺縮，48小時部分胞漿內(nèi)見空泡變性，72小時為凋亡高峰，可見核固縮、核仁裂

5、解、細胞內(nèi)染色質(zhì)凝集，細胞部分裂成數(shù)個質(zhì)膜包裹小體即凋亡小體。 (2) MTT結(jié)果顯示：在同一時點，與對照組相比，單藥組與聯(lián)合組均使NB4細胞生存率顯著下降(P<0.01)，各組呈濃度效應(yīng)關(guān)系。同一藥物濃度作用于不同時點生存率也明顯不同(P<0.01)，呈時間依賴性。聯(lián)合組抑制作用明顯優(yōu)于單藥組，以1μmol/L ATO聯(lián)合10nmol/L BOR在72小時生存率最低(P<0.01)。 (3) 流式細胞儀結(jié)果顯示：BOR

6、組培養(yǎng)細胞48小時后，S期比例逐漸降低，G1期變化不明顯，而G2/M期逐漸升高，將細胞周期阻滯于G2/M期(P<0.01)，ATO組培養(yǎng)細胞48小時后，同樣將細胞周期阻滯于G2/M期(P<0.01)，聯(lián)合組處理細胞后，均使細胞周期阻滯于G2/M期(P<0.01)，兩種藥物之間存在交互作用，1μmol/L ATO聯(lián)合10 nmol/LBOR阻滯率最高，與相同劑量的ATO單用組比較，聯(lián)合組的阻滯率顯著增高(P<0.01)。 對細胞凋

7、亡的分析表明，BOR組處理細胞48小時后均可見凋亡亞G1期峰，而對照組無明顯凋亡峰，凋亡率的高低具濃度依賴性(P<0.01)。BOR能增強ATO對NB4細胞的凋亡作用，與相同劑量的ATO單用組比較，聯(lián)合組的凋亡率顯著增高(P<0.05)。兩種藥物之間存在交互作用，10 nmol/L BOR+1μmol/L ATO組處理后凋亡率最高(P<0.01)。 (4) PT-PCR檢測結(jié)果顯示：BOR組與ATO組均能下調(diào)抑凋亡基因survivin

8、的表達水平，并呈濃度和時間依賴性(P<0.01)。聯(lián)合組降低survivin的表達比單藥組明顯，聯(lián)合組與ATO組相同ATO濃度相比，同一時點survivin的表達量隨BOR濃度的升高而降低，差異具顯著性(P<0.01)。干預時相與兩藥干預濃度之間存在交互作用(P<0.01)，以1μmol/L ATO聯(lián)合10 nmol/L BOR在72小時survivin的表達量最低。 結(jié)論： (1) BOR與ATO單藥應(yīng)用均可誘導細胞凋