蛋白酶體抑制劑(PS-341)對神經(jīng)母細胞瘤的治療作用及機制研究.pdf

1、目的：PS-341(又名Bortezomib或Velcade)是一類可逆的選擇性蛋白酶體抑制劑，是首個由美國FDA批準(zhǔn)用于臨床多發(fā)性骨髓瘤治療的藥物。本課題主要探討PS-341對神經(jīng)母細胞瘤的治療作用，包括PS-341誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡，以及與全反式維甲酸(ATRA)聯(lián)合用于誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤細胞的分化治療，在此基礎(chǔ)上，進一步研究PS-341誘導(dǎo)細胞凋亡以及協(xié)同ATRA誘導(dǎo)細胞分化的分子機制。
　　 方法：1)選用神經(jīng)母細胞

2、瘤細胞株CHP126為研究對象，用PS-341處理72h后，采用MTT法檢測細胞生長情況并通過IC50計算軟件計算藥物作用于該細胞的IC50值；采用細胞計數(shù)板計數(shù)來檢測隨著藥物作用時間的延長CHP126細胞的增殖情況，并描繪細胞生長曲線；細胞經(jīng)碘化丙錠(P1)單染或是P1和Annexin V復(fù)染，用流式細胞分析術(shù)分析PS-341對細胞周期及凋亡的影響；采用DAPI染色來檢測細胞核形態(tài)的變化；通過Western blot栓測PS-341對

3、NFкB通路相關(guān)蛋白、p21蛋白及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3、PARP、Bcl-2及Bax表達水平的影響；應(yīng)用Real-time quantitative PCR assay檢測p21 mRNA的表達水平。2)選用神經(jīng)母細胞瘤細胞株CHP126及SH-SY5Y為研究對象，采用臺盼蘭染色法來檢測上述細胞對于PS-341及ATRA的敏感性，并選取引起細胞凋亡率不高于空白對照組5％的濃度為給藥濃度，將給藥方式設(shè)為PS-341

4、與ATRA單用組及兩藥合用組，采用細胞計數(shù)法來檢測各個給藥方式下神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖情況，并描繪細胞生長曲線；同時鏡下觀察并記錄給藥后細胞的形態(tài)學(xué)變化，運用ImagePro5.0軟件分析并統(tǒng)計細胞突觸的生長情況及細胞的分化百分率；采用細胞免疫熒光、Western blot檢測藥物對神經(jīng)母細胞瘤分化標(biāo)記物Tau及β-III Tubulin蛋白表達情況的影響，并檢測維甲酸相關(guān)受體RARα、RARβ及分化相關(guān)蛋白p27和JNK等蛋白的表達情

5、況；采用原代培養(yǎng)新生鼠海馬神經(jīng)元細胞，經(jīng)5 nMPS-341、20 nM PS-341、10 nM ATRA、5μM ATRA，5 nM PS-341與10 nMATRA合用處理原代神經(jīng)元細胞72 h，經(jīng)P1染色后用流式細胞分化術(shù)檢測海馬神經(jīng)元細胞的凋亡情況，并進一步檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2，caspase9及caspase3的表達情況。
　　 結(jié)果：1)PS-341作用CHP126細胞72 h的IC50值為11.25

6、 nM；用0、5、10及20 nM PS-341處理CHP126細胞24、48及72 h，細胞計數(shù)結(jié)果表明PS-341可顯著抑制CHP126細胞的增殖；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示PS-341并不影響CHP126的細胞周期分布，但是能顯著誘導(dǎo)CHP126細胞發(fā)生凋亡，其中5、10及20 nM PS-341作用72 h，CHP126細胞的凋亡率分別為14.6％、39.6％及58.2％，20 nM PS-341分別作用6、12、24、48和72

7、h后，CHP126細胞的凋亡率分別為15.3％、17.9％、18.3％及55-1％； DAPI染色結(jié)果顯示，PS-341藥物作用濃度的升高及藥物作用時間的延長都會導(dǎo)致CHP126細胞核固縮的加劇及凋亡小體的增多；Western blot結(jié)果顯示，PS-341作用于CHP126細胞，細胞核內(nèi)NFкB(p65)及胞漿中p-IкB及IкB蛋白的表達水平?jīng)]有變化，而p21蛋白和mRNA的表達水平都有較大的提高。同時，PS-341可顯著抑制CHP

8、126細胞中Bcl-2的表達，促進Bax的表達，伴隨著caspase3的裂解生成Cleaved caspase3，進而促使PARP發(fā)生水解，產(chǎn)生85 kd的裂解片段，最終引起細胞的凋亡。2)以不同濃度的PS-341與ATRA聯(lián)合應(yīng)用于神經(jīng)母細胞瘤CHP126及SH-SY5Y細胞72 h后，采用臺盼蘭染色確定細胞凋亡率，選取以引起的細胞凋亡率不高于陰性對照組5％的藥物濃度為本實驗的給藥濃度，PS-341為5 nM，ATRA為10nM。細胞

9、增殖實驗表明PS-341與ATRA合用可顯著抑制CHP126及SH-SY5Y細胞的增殖；且藥物合用組引起的細胞突觸的長度及細胞的分化百分率明顯高于單用組，其中ATRA單用組中細胞分化百分率為28.0％，ATRA與PS-341合用組可高達50.0％：細胞免疫熒光及Western blot結(jié)果顯示，PS-341單用并不會改變CHP126及SH-SY5Y細胞中Tau和β-III Tubulin的表達，ATRA單用可上調(diào)Tau和β-III Tu

10、bulin蛋白的表達水平，PS-341可協(xié)同ATRA顯著上調(diào)Tau和β-IIITubulin蛋白的表達水平。另外，ATRA可引起CHP126細胞中維甲酸受體RARα蛋白表達的下降，而PS-341與ATRA合用可增進RARα蛋白的累積，同時伴隨RARβ、JNK及p27蛋白表達的增加。此外，以不同濃度的PS-341與ATRA聯(lián)合應(yīng)用于新生鼠的海馬神經(jīng)元細胞，結(jié)果顯示5 nM PS-341、10 nMATRA單用或者合用均不會引起海馬神經(jīng)元細

11、胞的凋亡，而5μM ATRA作用72 h即可誘導(dǎo)24.02％的海馬神經(jīng)元細胞發(fā)生凋亡，20 nM PS-341引起的細胞凋亡率為58.77％；此外，20 nM PS-341作用72 h可顯著上調(diào)Bax蛋白的表達，5μM ATRA及20 nM PS-341都會下調(diào)Bcl-2、caspase9及caspase3蛋白的表達。
　　 結(jié)論：通過對PS-341體外誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤CHP126細胞凋亡及其聯(lián)合ATRA誘導(dǎo)神經(jīng)細胞瘤SH-SY

12、5Y及CHP126細胞分化的系統(tǒng)研究，我們得出以下結(jié)論：1)PS-341可誘導(dǎo)CHP126細胞發(fā)生凋亡，其機制主要是通過上調(diào)p21和Bax的表達，抑制Bcl-2的表達水平，提高了Bax/Bcl-2的比率，從而激活caspase3發(fā)生裂解，導(dǎo)致PARP裂解產(chǎn)生85 kd的裂解片段，阻礙了細胞DNA的自我修復(fù)，最終導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡；2)PS-341可協(xié)同ATRA抑制神經(jīng)母細胞瘤CHP126和SH-SY5Y細胞的增殖，并且伴隨著細胞分化水平的