蛋白酶體抑制劑增強TRAIL介導骨肉瘤細胞凋亡及抑制侵襲的研究.pdf

1、目的：
　　骨肉瘤是嚴重危害青少年健康的最常見惡性骨腫瘤，易早期肺轉移，預后極差。目前采用的保肢性手術聯合新輔助化療，可顯著提高患者術后生存率，治療效果優(yōu)于以往的截肢性手術，且因保留了肢體，使病人的生存質量顯著提高。但大量臨床實踐證明，大劑量聯合化療后骨肉瘤病人常產生耐藥性，使原本較為有效的化療藥物迅速失去對腫瘤組織的殺傷作用，從而導致瘤體復發(fā)或轉移。并且化療周期的進程將產生較為嚴重的對肝腎功能及各系統的毒副作用，許多病人甚至死因

2、并非是骨肉瘤疾病本身，而是化療藥帶來的多系統功能損害。泛素-蛋白酶體系統是細胞內蛋白質降解的主要途徑，參與細胞內80％以上蛋白質的降解。近來應用蛋白酶體抑制劑改變其酶切位點活性已成為抗腫瘤治療的研究熱點。本實驗通過應用蛋白酶體抑制劑來探討克服骨肉瘤細胞對TRAIL耐藥的機制，從而增強TRAIL對骨肉瘤細胞的殺傷作用。
　　方法：
　　常規(guī)培養(yǎng)和傳代人骨肉瘤細胞系OS732細胞，取對數生長期的細胞，加入不同濃度的蛋白酶體抑制劑

3、MG132，MTT法檢測細胞增殖。實驗分為四組:對照組:細胞正常培養(yǎng)不加處理因素;TRAIL組:終濃度為1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml;MG132組:0.1μM，1μM，10μM，聯合組:100ng/mlTRAIL和10μMMG132。培養(yǎng)24小時后，AnnexinV-FITC/PI流式檢測OS732細胞凋亡，流式細胞技術檢測各組細胞周期情況，提取細胞總蛋白，Westernblot檢測Caspase通路中Caspase-

4、3，8的表達水平，免疫熒光觀察細胞凋亡。采用SPSS19.0統計學軟件進行統計學分析。數據采用(x)±s表示，多組間差異顯著性選用單因素方差分析多組間比較，組間比較選用SNK方法，P＜0.05表明具有統計學意義。
　　結果：
　　不同濃度的TRAIL作用于OS732細胞后，細胞未出現明顯的凋亡增加現象。不同濃度的MG132作用于OS732細胞后，細胞出現凋亡增加，但作用不是很明顯。我們發(fā)現聯合TRAIL和MG132以后，與對

5、照組及單獨應用組相比，凋亡率明顯增加，在應用Caspase相關抑制劑以后，上述現象消失。細胞周期顯示細胞被阻滯在G2-M期。聯合組骨肉瘤OS732的遷移能力受到明顯抑制。Caspase通路中的Caspase3，8的表達明顯增加，DR5及P27kip1的表達也明顯升高，而MMP-9的表達降低。
　　結論：
　　MG132聯合TRAIL能顯著殺傷骨肉瘤OS732細胞，顯著抑制骨肉瘤OS732細胞的侵襲轉移能力。激活Caspase