蛋白酶體抑制劑bortezomib逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞獲得性TRAIL耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文蛋白酶體抑制劑btezomib逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞獲得性TRAIL耐藥的機(jī)制研究姓名：陳琳琳申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：何超20080401浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文關(guān)蛋白的表達(dá)水平；用wbStem免疫印跡法聯(lián)合Optimaus軟件檢測細(xì)胞中Bik蛋白的穩(wěn)定性，并進(jìn)行相對(duì)定量和計(jì)算半衰期；通過轉(zhuǎn)染Bil【si對(duì)臨阻斷Bik蛋白表達(dá)后再用流式細(xì)胞儀檢測各處理組的細(xì)胞凋亡率。各處理組間的差異采用非配對(duì)的芒檢驗(yàn)來評(píng)估

2、?！窘Y(jié)果和討論】1)Bortezomib聯(lián)合重組人矸認(rèn)IL蛋白逆轉(zhuǎn)DLDl細(xì)胞對(duì)TRAIL的獲得性耐藥：用不同濃度(O5斗M一50“M)的bonezomib聯(lián)合重組人TRAIL蛋白(20ng／m1)處理DLDlTRAIL瓜細(xì)胞后，MTT比色法檢測結(jié)果顯示，聯(lián)合作用4小時(shí)和24小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，聯(lián)合處理組細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞存活率較單用bonezomib組均有明顯下降(p005)，說明bortezomib使獲得性TI認(rèn)IL耐藥的DLDlTRAIL

3、瓜細(xì)胞對(duì)TRAIL蛋白治療重新敏感。進(jìn)一步的流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理組細(xì)胞大量停滯于G1期；2)BonezoIllib聯(lián)合重組人TRAIL蛋白活化耐藥細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路：Wbstem免疫印跡結(jié)果顯示，bortezomib(1“M)聯(lián)合重組人n認(rèn)IL蛋白(20n咖1)處理后，DLDlTR舭L瓜細(xì)胞中各種凋亡信號(hào)分子包括caspaSe_8，caspaSe9，caSpaSe3，Bid，Pf6d嬸蛋白均明顯活化，線粒體中的細(xì)胞色素C和smaC

4、蛋白大量地釋放到細(xì)胞漿中，這些結(jié)果提示bonezoIIlib有效地放大了，n認(rèn)IL介導(dǎo)的凋亡信號(hào)，這一放大作用可能主要是通過它啟動(dòng)線粒體凋亡途徑而發(fā)揮作用的；3)Bonezomib上調(diào)耐藥細(xì)胞中DR5和Bik蛋白的表達(dá)：為解釋bonezoIllib逆轉(zhuǎn)矸認(rèn)IL耐藥的可能機(jī)制，我們進(jìn)一步用w|estem免疫印跡法檢測可能成為蛋白酶體抑制劑作用靶點(diǎn)的凋亡信號(hào)分子，包括DIⅥ、DR5、Bcl2家族成員以及XIAP和SurViv訪等蛋白分子，發(fā)

5、現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)蛋白Bik的表達(dá)水平明顯增高，死亡受體DR5的表達(dá)輕微增高，而其他分子卻無明顯變化；4)Bonezomib顯著提高耐藥細(xì)胞中Bik蛋白的穩(wěn)定性：為了進(jìn)一步闡明bonezomib上調(diào)Bil【蛋白的機(jī)理，我們用PBS和bortezomib(1肛M)分別處理DLDl一TRAIL瓜細(xì)胞6小時(shí)，再加入CycloheXimide(25∥m1)抑制新蛋白的合成，收集細(xì)胞蛋白行wbstem免疫印跡檢測Bik蛋白的表達(dá)，并利用0ptilllaS