蛋白酶體抑制劑MG-132對結(jié)腸癌細(xì)胞株lovo細(xì)胞腺病毒柯薩奇病毒受體表達(dá)的影響.pdf

1、目的： 以腺病毒為載體的基因治療療效備受爭議。在大多數(shù)情況下，腺病毒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞依賴于其主要受體--腺病毒柯薩奇病毒受體(CAR)的表達(dá)。然而，在許多惡性腫瘤細(xì)胞中CAR的表達(dá)水平較低，低水平的CAR表達(dá)被認(rèn)為是以腺病毒為載體的基因治療療效不佳的原因之一。因此，提高CAR在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)成為增強(qiáng)腺病毒基因治療療效研究中一個非常具有希望的方向。蛋白酶體是真核細(xì)胞蛋白降解的主要場所。最近隨著一些選擇性蛋白酶體抑制劑的問世，為研究泛素．

2、蛋白酶體途徑在不同信號通路中的作用提供了可能。目前，尚未見有關(guān)蛋白酶體抑制劑類藥物對CAR．表達(dá)影響的報道。在本研究中，我們運(yùn)用免疫組化的方法分析了CAR在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析蛋白酶體抑制劑MG-132對結(jié)腸癌細(xì)胞株Iovo細(xì)胞CAR表達(dá)的影響。 方法： 采用免疫組織化學(xué)的方法檢測CAR在結(jié)腸腫瘤中的表達(dá)，分析CAR的表達(dá)與臨床及病理特征之間的關(guān)系。預(yù)先進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)以確定MG-132及TSA(trichost

3、atin A，曲古抑菌素，陽性對照用藥)對腫瘤細(xì)胞株的最低有效劑量。運(yùn)用流式細(xì)胞法、RT-PCR法及western blot法檢測CAR在經(jīng)MG-132或TSA處理前后的表達(dá)情況。為進(jìn)一步定性及定量分析經(jīng)MG-132或TSA處理后腺病毒的轉(zhuǎn)染效率，我們使用重組增強(qiáng)綠色熒光蛋白腺病毒(tAd．EGFP)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后，采用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀分析其轉(zhuǎn)染效率。為分析經(jīng)MG-132或TSA處理后對腺病毒藥物體外效果的影響，我們使用重組人p53

4、腺病毒(tAd．p53)或溶瘤型腺病毒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，運(yùn)用western blot法分析經(jīng)rAd．p53轉(zhuǎn)染后p53及p21的表達(dá)情況，運(yùn)用MTT法檢測溶瘤型腺病毒的體外抗腫瘤效應(yīng)。 結(jié)果： 與瘤旁結(jié)腸上皮組織相比，結(jié)腸腫瘤組織中普遍存在著CAR的表達(dá)丟失或下調(diào)(p<0.01)，但CAR在原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平并無明顯差異。此外，結(jié)腸腫瘤組織中CAR的表達(dá)丟失或下調(diào)還與患者的年齡(p=0.0395)及腫瘤大小(p=

5、0.0115)密切相關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)中MG-132或TSA所用劑量對腫瘤細(xì)胞沒有或僅有較小細(xì)胞毒性。FCM分析lovo細(xì)胞經(jīng)MG-132(1.5umol/L)或TSA(30ng/ml)處理兩天后CAR的表達(dá)情況，lovo細(xì)胞CAR的陽性表達(dá)率由處理前的3.4±1.0％分別升至23.5±2.6％和36.5±2.6％。運(yùn)用RT-PCR及western blot法分析藥物處理前后CARmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的變化發(fā)現(xiàn)，lovo細(xì)胞經(jīng)TSA處

6、理后，其CAR mRNA及蛋白質(zhì)的水平皆得到不同程度的提高。lovo細(xì)胞經(jīng)MG-132處理后并不能提高CAR mRNA的表達(dá)水平，但同樣也能提高CAR蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。我們運(yùn)用25、50或100 MOI的rAd．EGFP轉(zhuǎn)染lovo細(xì)胞證實(shí)，經(jīng)MG-132或TSA處理后能夠提高目的基因的表達(dá)水平。在50 MOI的情況下，未加藥物處理組、MG-132處理組及TSA處理組GFP的表達(dá)率分別為：26.5±2.1％、49.7±5.3％和62.1

7、±7.0％。此外，rAd．p53與MG-132或TSA聯(lián)合應(yīng)用時，能夠明顯地提高p53及p21的表達(dá)水平。lovo細(xì)胞經(jīng)或不經(jīng)MG-132或TSA處理后，在體外轉(zhuǎn)染50 MOI的溶瘤型腺病毒，結(jié)果顯示：藥物處理組lovo細(xì)胞的生長抑制率較對照組明顯提高。 結(jié)論： 在結(jié)腸腫瘤組織中普遍存在CAR的表達(dá)丟失或下調(diào)，提示在設(shè)計腺病毒載體基因治療方案時應(yīng)充分考慮CAR表達(dá)變化對療效的影響。與TSA相比，蛋白酶體抑制劑MG-132