蛋白酶體抑制劑MG-132對(duì)大鼠心肌缺血-再灌注損傷的影響研究.pdf

1、1、目的和意義 泛素一蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)參與了細(xì)胞內(nèi)80％以上的蛋白質(zhì)更新，與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)、炎癥過程相關(guān)，其功能異常會(huì)引起一系列病理變化。目前認(rèn)為，炎癥性損傷和細(xì)胞凋亡是心肌缺血／再灌注損傷的重要機(jī)制，核因子．κB(NF。κB)在炎癥和凋亡過程中起著中心作用，由于缺血／再灌注使UPS的活性增加從而激活NF．κB，故本研究將蛋白酶體抑制劑MG．132用于大鼠心肌缺血／再灌注損傷模型，旨在觀察能否抑制心肌的炎

2、癥性損傷及細(xì)胞凋亡，具有心肌保護(hù)作用。 2．研究方法 結(jié)扎SD大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)30min制作心肌缺血／再灌注模型，30只動(dòng)物隨機(jī)分為以下各組：(1)130min組，結(jié)扎LAD30min不實(shí)施再灌注；(2)130min／R6h組，結(jié)扎LAD30min再灌注6h，并于結(jié)扎LAD25min，即再灌注前5min靜脈注射生理鹽水5ml；(3)130min／R6hq-T組，結(jié)扎LAD30min再灌注6h，并于結(jié)扎LAD

3、25min，即再灌注前5min靜脈注射蛋白酶體抑制劑MG-1320．75mg／kg(溶于5ml生理鹽水中)；(4)ShamA組：手術(shù)過程同130min組，但只穿線不打結(jié)。以上除ShamA組為6只大鼠外，其它各組均為8只。通過心肌紅四唑(TTC)染色觀察上述各組心肌梗死體積(MIV)、心肌梗死體積／左室心肌體積(MIV／LVWV)×100％，并分別檢測(cè)血漿肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌鈣蛋白I(TnI)水平變化。

4、 另外92只SD大鼠分為以下四組：(1)缺血／再灌注+治療(I／R+T)組，結(jié)扎大鼠LAD30min后再灌注不同時(shí)間，于再灌注前5min靜脈注,NMG一1320．75mg／kg(溶于5ml生理鹽水中)，并根據(jù)再灌注時(shí)間的不同，將該組分為I／ROh、I／R1h、I／R2h、I／R6h、I／R24h5個(gè)亞組，每個(gè)亞組8只大鼠；(2)缺血／再灌注對(duì)照(I／R)組，缺血和再灌注時(shí)間以及分組的情況完全同I／R+T組，每個(gè)亞組8只大鼠，于再灌注前

5、5min靜脈注入5ml生理鹽水；(3)假手術(shù)B(ShamB)組，手術(shù)過程同I／R組，但只穿線不打結(jié)，以穿線后開始，觀察150min，穿線后25min時(shí)靜脈注入5ml生理鹽水；(4)假手術(shù)B+T(ShamB+T)組：手術(shù)過程及觀察時(shí)間同ShamB組，但于穿線25min靜脈注入MG一1320．75mg／kg(溶于5ml生理鹽水中)；假手術(shù)B和假手術(shù)B+T組各6只大鼠。記錄所有大鼠手術(shù)前、結(jié)扎LAD即刻、結(jié)扎LAD后30min、再灌注30mi

6、n、再灌注2h的心電圖，ShamB組和ShamB+T組在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)記錄心電圖。觀察NF．κBp65、TNF．α水平，梗死周圍心肌組織的PMN計(jì)數(shù)和MPO活性，檢測(cè)梗死周圍心肌組織中凋亡蛋白的表達(dá)以及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，電鏡下觀察再灌注2h、6h及24h各亞組的心肌超微結(jié)構(gòu)變化，并計(jì)算各組存活率，分析各組大鼠心律失常的發(fā)生情況。 3．結(jié)果 (1)130min組的MIV總和為1．12cm3，占左室心肌體積的36％。130mi

7、niR6h組的MIV和MIV／LVWV分別是0．87cm3和27％，比130min組顯著減少，p<0．05。130min／R6h-I-T組的MIV以及MIV／LVWV分別為0．47cm3和16％，與130min／R6h組相比，MIV明顯縮小(p＜0．01)。 (2)雖然130min／P-6h+T組的血漿CK、CK-MB、TnI均顯著高于ShamA組和130min組，但是比130min／R6h組低(p＜0．05)。 (3)

8、MG．132顯著降低了心律失常的發(fā)生，使因惡性心律失常死亡的大鼠由I／R組的39％下降至I／R+T組的15％(p＜0．05)，并使存活率由I／R組的78％提高至I／R+T組的90％(p＜0．05)。 (4)缺血／再灌注促進(jìn)了I／R各亞組心肌組織中白細(xì)胞的聚集，I／ROh、m、2h、6h和24h各亞組分別為每高倍鏡視野5．6個(gè)、10．1個(gè)、33．7個(gè)、29．1個(gè)和28．8個(gè)，與ShamB和ShamB+T組(分別為0．9個(gè)和1．O個(gè)

9、)相比，差異有顯著性，p<0．05；除I／R+TOh亞組外，MG—132顯著抑制了I／R+Tm、2h、6h和24h各亞組梗死周圍心肌組織白細(xì)胞的聚集，分別為每高倍鏡視野8．4個(gè)、6．6個(gè)、6．4個(gè)和7．6個(gè)，與I／R各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)亞組心肌組織白細(xì)胞計(jì)數(shù)相比，p＜0．05。 ShamB和ShamB+T組心肌組織的MPO活性(單位：U／mg蛋白質(zhì))分別為1．O和0．98，與之相比，I／R各亞組心肌組織MPO活性顯著增加，分別為4．0、

10、10．3、15．6、13．3和8．3，于再灌注2h達(dá)到高峰。除I／R+TOh亞組外，MG一132顯著降低了I／R+T各亞組的MPO活性，I／R+T1h、2h、6h和24h各亞組分別為4．7、6．1、6．4、5．1，I／R+T2h亞組降低最顯著，與I／R各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)亞組的MPO活性相比，p＜0．05。 (5)透射電鏡檢查結(jié)果顯示：I／R各亞組電鏡下可見彌漫性心肌細(xì)胞腫脹，肌絲溶解，Z線增寬、模糊，24h組可見線粒體空泡樣變性。與U

11、R組相比，I／R+T組心肌細(xì)胞損傷程度大大減輕，僅部分區(qū)域線粒體輕度腫脹，肌絲間隙增寬，肌絲部分溶解。 (6)ShamB組和ShamB+T組的NF．κBp65陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)分別為1．2±0．5和14±0．4，以GAPDH為內(nèi)參，mRNA密度值分別為6．67±1．24和5．98±1．36。與其相比，I／R各亞組NF．κBp65的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平顯著增加，I／R2h亞組最高(分別為21．O±2．6和150．35±3．26)，此

12、后持續(xù)較高水平存在，24h為15．4±3．4和109．83±5．78。MG一132顯著降低了缺血30min再灌注不同時(shí)間點(diǎn)NF．κB蛋白質(zhì)和mRNA的水平，并以I／R+T2h亞組作用最顯著，分別為7．0±3．2和35．96±5．65，與I／R2h組相比，p=0．006和p=0．008，而且該抑制作用于再灌注24h后依然明顯。NF．κBp65陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)和以GAPDH為內(nèi)參的mRNA密度值分別是10．0±2．0和61．25±6．26，雖然

13、高于假手術(shù)組，但是顯著低于UR24h組(p<0．05)。 (7)與假手術(shù)B組相比，從缺血30min開始I／R組各時(shí)間點(diǎn)的TNF．α的積分光密度值和以GAPDH為內(nèi)參的mRNA密度值逐漸增加，再灌注6h達(dá)到最大，分別為87．88±3．29和232．79±19．47，I／R24h分別為80．36±3．94和214．69±19．98；與UR各亞組相比，I／R+T各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)亞組的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)明顯降低(p<0．05)，I／R+T

14、6h和I／R+T24h亞組分另U是39．47±5．97和¨9．81±19．47，37．52±4．34和¨9．91±19．98，I／R+T6h亞組的上述各值分別降低55％和49％，I／R+T24h亞組降低54％和44％。 (8)對(duì)各組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)進(jìn)行比較，其中I／R組及I／R+T組中的再灌注Oh和1h亞組的凋亡指數(shù)與ShamB組和ShamB+T組相比均無(wú)顯著差異。I／R2h、I／R6h和I／R24h~31}組的凋亡指數(shù)均顯著

15、增高，分別為12．78±0．58、29．47±2．36和44．39±4．02。而MG．132治療組中的I／R+T2h、6h及24h~3E組的凋亡指數(shù)比I／R組相應(yīng)各組均顯著降低，分別為4．58±0．68、13．23±2．13和22．29±2．87，p<0．01。 (9)ShamB組、ShamB+T組以及I／R組和I／R+T組的Oh、1h亞組Bax蛋白以及Bcl-2蛋白水平變化無(wú)明顯差異。從再灌注2h開始，I／R各亞組Bax蛋白的

16、積分光密度值依次升高，I／R2h、6h和24h分別為5．45、16．06和31．33，24h達(dá)到最高；這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Bcl-2蛋白分別為3．43、4．20和6．09，雖然也有依次增高的趨勢(shì)，但升高程度明顯低于Bax，因此各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2／Bax比值顯著降低，分別為0．63、0．26和O．19，并于再灌注24小時(shí)達(dá)到最低。與I／R2h、6h和24h亞組相比，MG．132顯著降低了I／R+T2h、6h和24h各亞組Bax蛋白的積分光密度值

17、，分別為3．44、8．78和16．02，p<0．05；顯著升高了I／R+T2h、6h和24h各亞組Bcl-2蛋白的積分光密度值，分別為4．07、13．59和37．38，p<0．05；并使I／R+T2h、6h和24h各亞組的Bcl-2／Bax比值顯著增加，分別為1．18、1．55和2．33，p<0．05，I／R+T24h組的Bcl-2／Bax是I／R24h組的12倍。 4．結(jié)論 (1)蛋白酶體抑制劑MG一132顯著減少了大

18、鼠缺血／再灌注后的心肌梗死體積，降低了心肌損傷標(biāo)志物水平，減少了心肌組織白細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而表明，MG一132抑制了心肌梗死后再灌注的心肌細(xì)胞損傷。 (2)蛋白酶體抑制劑MG一132抑制心肌缺血／再灌注損傷的機(jī)制與抑制NF．κB激活，下調(diào)炎癥因子TNF一α的表達(dá)相關(guān)。 (3)蛋白酶體抑制劑MG—132通過抑制凋亡刺激基因Bax、上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，使Bcl-2／Bax的比值增加，達(dá)到了抑制心肌細(xì)胞凋亡，抑制再