鈣蛋白酶抑制劑MDL28170減輕大鼠心肌缺血-再灌注損傷.pdf

1、研究背景:缺血/再灌注損傷是制約急性心肌梗死溶栓術(shù)、體外循環(huán)心臟術(shù)后臨床療效的瓶頸因素,探討細(xì)胞損傷機(jī)制及尋找有效的防治策略具有重要意義。我們和他人的研究發(fā)現(xiàn),抑制鈣蛋白酶(calpain)活性顯著減輕離體條件下缺血/再灌注和鈣超載引起的心肌損傷,那么鈣蛋白酶是否為整體水平心肌缺血/再灌注損傷的關(guān)鍵分子?其作用的可能機(jī)制是什么?本課題擬:①在整體動(dòng)物水平評(píng)價(jià)鈣蛋白酶抑制劑 MDL28170對缺血/再灌注心肌凋亡、梗死面積的影響,以進(jìn)一步

2、明確鈣蛋白酶在缺血/再灌注損傷中的作用;②觀察 MDL28170對生存分子Akt及其下游底物分子糖原合成酶激酶(GSK3b)活性的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法:SD雄性大鼠(體重250~300 g),隨機(jī)分為四組,①假手術(shù)組.:常規(guī)方法麻醉與肝素化,開胸并分離左冠狀動(dòng)脈,僅穿線,不夾閉;②藥物對照組:操作步驟與假手術(shù)組相同,并于穿線后一次性靜脈給予MDL28170(1.5,3.0或4.5 mg/kg b.w.);③缺血/再灌注組:夾閉冠狀

3、動(dòng)脈40 min,再灌注2 h;④缺血/再灌注加 MDL28170處理組:于缺血前5 min給予MDL28170,之后缺血40 min,再灌注2 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,常規(guī)伊文氏藍(lán)-TTC雙染心臟切片,以缺血區(qū)/左心室(Area at risk/Left ventricle,AAR/LV)的比值來判斷缺血范圍是否一致。梗死區(qū)/缺血區(qū)(Infarct size/Area at risk,IS/AAR)的比值表示梗死面積,比色法測定血清乳酸脫氫酶

4、(LDH)含量;采用 ELISA試劑盒檢測血清肌鈣蛋白C(cTnI)含量;TUNEL染色和caspase3活性測定評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡,Western blot檢測 Akt308和473位點(diǎn)以及下游底物GSK3b的磷酸化水平評(píng)價(jià) Akt活性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:①實(shí)驗(yàn)各組間 AAR/LV的比值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說明各組的冠脈結(jié)扎部位相同,具有可比性。與假手術(shù)組相比,缺血/再灌注組心肌出現(xiàn)大片梗死區(qū),IS/AAR達(dá)43.2±5.8％,血清 LDH濃

5、度為假手術(shù)組的10.9±1.2倍(P<0.01,n=4);MDL28170在1.5,3.0和4.5 mg/kg b.w.時(shí)使得缺血/再灌注心肌梗死面積分別縮小至35.0±4.1%,27.2±3.1%(P<0.01,n=5),8.3±1.4%(P<0.01,n=5);同時(shí),3.0 mg/kg b.w.MDL28170顯著降低血清 LDH含量,僅為假手術(shù)組的1.3±0.3倍(P<0.01,n=4),MDL28170對正常心臟無明顯影響。

6、r>　　②與假手術(shù)組相比,缺血/再灌注組心肌 caspase3活性顯著增加,TUNEL染色顯示細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著上升,表明缺血/再灌注心肌出現(xiàn)細(xì)胞凋亡(P<0.01,n=4);MDL28170(3.0 mg/kg b.w.)不影響正常心肌凋亡,然而顯著降低心肌 caspase3活性,下調(diào)細(xì)胞凋亡指數(shù)(P<0.01,n=4)。
　　③缺血/再灌注大鼠血清 cTnI含量顯著增加(與假手術(shù)組相比,P<0.05,n=4),3.0 mg/kg

7、 b.w.MDL28170雖未顯著降低缺血/再灌注大鼠血清 cTnI含量,但有下降趨勢。
　?、芘c假手術(shù)組相比,缺血/再灌注組心肌 Akt-Thr308和Akt-Ser473位點(diǎn)磷酸化水平顯著上調(diào)(P<0.01,n=4),其底物 GSK3b-Ser9的磷酸化水平也顯著上調(diào)(P<0.01,n=4),MDL28170(3.0 mg/kg b.w.)對正常心臟無明顯影響,然而與預(yù)期結(jié)果不同,MDL28170減少 Akt-Thr308(P