UTP對大鼠心肌缺血-再灌注損傷的影響.pdf

1、三磷酸腺苷(ATP)作為細胞外信號分子的功能早已受到人們的關(guān)注并得到研究確認，很多類型的細胞在一定條件下均可釋放ATP等核苷酸分子；ATP還是神經(jīng)末梢遞質(zhì)，參與神經(jīng)興奮傳導(dǎo)。由于核苷酸類受體的多樣性以及物種間的差異，胞外核苷酸及其受體的生理功能還不是非常明確。
　　胞外尿苷三磷酸(UTP)與ATP同是信號遞質(zhì)，參與機體生理病理過程的調(diào)節(jié)。P2受體是嘌呤與嘧啶受體(Preceptors，receptorsforpurinesandp

2、yrimidines)的一大類，其內(nèi)源性配體主要是ATP和UTP以及它們的水解產(chǎn)物。P2受體分為配體門控離子通道受體——P2X受體和G-蛋白偶聯(lián)離子通道受體——P2Y受體，這兩類受體又有諸多亞型。這些受體亞型雖然結(jié)構(gòu)相似但生理功能及藥理性質(zhì)有很大差異，并且各種亞型之間對于同種配體的親和力不同。
　　與ATP相比，對于UTP也是一種細胞外信號分子的認識較晚，細胞可自分泌或者旁分泌UTP的假說最近才得到實驗支持，UTP的研究成為了新的

3、熱點。細胞持續(xù)釋放UTP以維持正常的生理功能，在一些病理情況下細胞也可釋放UTP，例如心肌梗塞后冠脈竇血液中的UTP濃度升高.。研究發(fā)現(xiàn)，UTP預(yù)處理的心肌細胞對缺氧/復(fù)氧損傷的耐受性提高，在體實驗表明UTP可改善大鼠心肌梗塞后的心臟功能和形態(tài)學(xué)指標。UTP預(yù)處理保護心肌的作用機制還不明確，而且，尿苷的類似物腺苷可通過觸發(fā)/介導(dǎo)缺血預(yù)處理效應(yīng)而保護心肌。本研究旨在明確介導(dǎo)UTP心肌預(yù)保護效應(yīng)的受體以及闡明其可能的機制。
　　本研究

4、分為兩部分：
　　一、間接體內(nèi)實驗：即活體給藥后的離體心臟灌流實驗
　　實驗?zāi)康模禾接慞2Y受體激動劑UTP對于大鼠心臟缺血/再灌注損傷(I/RI)的延遲性保護作用。
　　實驗方法：將24只SD(Sprague－Dawley)大鼠隨機分為4組：對照組（靜脈注射9g/L生理鹽水）、UTP組（靜脈注射UTP4.4μg/kg）、UTP+蘇拉明(suramin,SRM)組（靜脈注射4.4μg/kgUTP前5min注射30μg/

5、kgSRM）及SRM組（靜脈注射30μg/kgSRM）。所有大鼠尾靜脈給藥24h后，建立Langendorff離體心臟灌流模型。平衡10min后全心停灌，25min后復(fù)灌，持續(xù)再灌注40min。記錄心臟缺血/再灌注前后血流動力學(xué)指標，觀察心肌超微結(jié)構(gòu)，記錄心臟表面心電圖計算心律失常的發(fā)生頻率，收集冠脈流出液，用全自動生化分析儀測量乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量。將剩余心肌組織用4％多聚甲醛溶液固定后包埋切片，免疫熒光染色確認成熟大鼠心臟中

6、是否存在P2Y2受體和P2Y4受體。
　　實驗結(jié)果：復(fù)灌后心臟復(fù)跳的第5min和25min時，UTP組的左室發(fā)展壓(LVDP)、等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升/下降最大速率(±dp/dtmax)恢復(fù)率均優(yōu)于對照組(P<0.01)；冠脈流出液中LDH的水平明顯值降低(P<0.01)；復(fù)灌第5-15min和第25-35min時的心律失常的發(fā)生頻率均顯著下降(P<0.01)；心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷減輕。而以SRM與UTP同時作用后，UTP對心臟

7、的保護作用則被取消。SRM組與對照組相比各項指標無明顯變化。心肌組織切片的免疫熒光染色表明，成熟大鼠的心肌確實分布有P2Y2受體和P2Y4受體。
　　結(jié)論：UTP預(yù)處理可對心臟I/RI產(chǎn)生延遲性拮抗作用；而P2Y受體拮抗劑SRM可取消這種作用，表明UTP對心臟的保護作用是通過P2Y受體介導(dǎo)的，由于UTP對P2Y2受體和P2Y4受體親和力較高且這兩種受體廣泛分布于成熟大鼠的心肌，那么UTP的心肌保護作用可能是通過這兩個P2Y受體的亞

8、型介導(dǎo)的。
　　二、心肌細胞實驗
　　實驗?zāi)康暮头椒?br>　　1、ATP對心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響
　　目的：通過觀察ATP預(yù)處理心肌細胞是否和UTP一樣具有拮抗缺氧/復(fù)氧損傷的作用探討介導(dǎo)UTP類物質(zhì)心肌保護作用的P2Y受體亞型。
　　方法：實驗分組：①正常對照組；②陽性對照組即缺氧/復(fù)氧組（缺氧12h，復(fù)氧4h）；③低劑量ATP預(yù)處理組（缺氧/復(fù)氧處理前24h加3μMATP）；④中劑量ATP處理組（AT

9、P15μM）；⑤高劑量ATP（ATP50μM）。用全自動生化分析儀檢測細胞復(fù)氧液中LDH的釋放量。
　　2、UTP對心肌細胞缺氧/復(fù)氧后細胞凋亡的影響
　　目的：通過流式細胞儀檢測UTP對于心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷引起凋亡的抑制作用。
　　方法：實驗分組：①正常對照組；②陽性對照組即缺氧/復(fù)氧組（缺氧12h，復(fù)氧4h）③UTP預(yù)處理組（缺氧/復(fù)氧處理前24h加50μMUTP）；④UTP和SRM處理組（SRM300μM，1

10、5min后加UTP50μM）。收集缺氧/復(fù)氧處理后的心肌細胞，進行流式細胞儀檢測。
　　3、Ca2+在UTP保護心肌缺氧/復(fù)氧損傷中的作用
　　目的：明確細胞外Ca2+在P2Y受體介導(dǎo)的UTP心肌預(yù)保護中的作用。方法：實驗分組：①正常對照組；②陽性對照組即缺氧/復(fù)氧組（缺氧12h，復(fù)氧4h）；③含Ca2+培養(yǎng)基UTP預(yù)處理組（缺氧/復(fù)氧處理前24h加UTP50μM）；④無Ca2+培養(yǎng)基UTP處理組（缺氧/復(fù)氧處理前24h用無

11、鈣培養(yǎng)基置換原有培養(yǎng)基，加UTP50μM，再加入含鈣培養(yǎng)基）。用全自動生化分析儀檢測細胞復(fù)氧液中LDH的釋放量。
　　實驗結(jié)果：
　　1、ATP預(yù)處理的心肌細胞缺氧/復(fù)氧后，與對照組相比，低劑量組和中劑量組細胞培養(yǎng)液中LDH的釋放量沒有差別，高劑量組的LDH釋放量增多。
　　2、UTP預(yù)處理的心肌細胞凋亡早期百分率較對照組明顯降低，而SRM與UTP合用時，凋亡早期的心肌細胞百分率升高。
　　3、與對照組相比，無C

12、a2+培養(yǎng)基和含Ca2+培養(yǎng)基中的心肌細胞在缺氧/復(fù)氧處理后LDH的釋放量均減少。而無Ca2+培養(yǎng)基組和含Ca2+培養(yǎng)基組之間LDH的釋放量沒有顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　1、ATP預(yù)處理不能產(chǎn)生心肌預(yù)保護作用，由于大鼠P2Y4受體與UTP和ATP的親和力相當(dāng)而P2Y2受體對ATP的親和力較UTP差，那么可推斷UTP的心肌保護作用主要是由P2Y2受體介導(dǎo)的。
　　2、UTP預(yù)處理可通過抑制細胞的凋亡而保護心肌細胞。<