衰老對大鼠心肌缺血-再灌注損傷中活性氮簇的影響.pdf

1、本文研究目的： 1．觀察衰老心肌組織中的NO及其衍生物(RNS)的含量變化； 2．探討衰老心肌組織中RNS含量變化的機制及其與衰老心臟對缺血/再灌注損傷易感性增加的關(guān)系。 研究方法： 選取健康雄性成年SD大鼠(4-6月齡)72只和老年SD大鼠(22-24月齡)90只，隨機分為9組： ①離體成年組(n=6)：離體心臟灌流不給予干預因素； ②離體老年組(n=6)：離體心臟灌流不給予干預因素；

2、 ③離體成年+腺苷組(n=6)：離體心臟灌流時加入腺苷溶液5μmol/L； ④離體老年+腺苷組(n=6)：離體心臟灌流時加入腺苷溶液5μmol/L： ⑤正常成年組(n=36)：經(jīng)右側(cè)頸總動脈插管進入大鼠左心室，監(jiān)測心功能，不結(jié)扎冠狀動脈； ⑥正常老年組(n=36)：經(jīng)右側(cè)頸總動脈插管進入大鼠左心室，監(jiān)測心功能，不結(jié)扎冠狀動脈； ⑦成年心肌缺血/再灌注組(成年MI/R組n=24)：左冠狀動脈前降支缺血

3、30min，再灌注3h； ⑧老年心肌缺血/再灌注組 (老年MUR組n=24)：左冠狀動脈前降支缺血30min，再灌注3h； ⑨老年缺血/再灌注組+1400W組(老年MI/R+1400W組n=18)：左冠狀動脈前降支缺血30min，再灌注3h，缺血前24小時及再灌注前25分鐘腹腔注射1400W(2mg/kg)。 本實驗用硝酸鹽/亞硝酸鹽比色測定試劑盒乳酸脫氫酶(LDH)法檢測離體心臟灌流冠脈流出液中總一氧化氮(NO

4、x)含量、在體監(jiān)測各項心功能指標、以Evanse blue和TTC復染法檢測缺血/再灌注后大鼠心肌梗死面積；以敏感性較高的TUNEL染色法和特異性較強的心肌組織caspase-3活性測定法檢測心肌細胞凋亡程度、分別以免疫組織化學法和雙抗體夾心ELISA法檢測心肌組織硝基酪氨酸(NT)含量、以Western-blot法測定心肌細胞誘生型一氧化氮合酶(iNOS)的表達。 研究結(jié)果： 1．衰老心肌活性氮簇的改變。 1．

5、1衰老心臟中基礎(chǔ)NO產(chǎn)生增加，但激動劑刺激的NO產(chǎn)生減少用離體心肌灌流技術(shù)發(fā)現(xiàn)，成年大鼠心臟的NOx基礎(chǔ)水平較低，注入腺苷后NOx產(chǎn)量明顯增加(P<0.01，圖1)；老年大鼠心臟的NOx基礎(chǔ)水平明顯高于成年心臟(P<0.01，圖1)，然而注入腺苷后，NOx產(chǎn)量只有輕微升高。 1．2老年大鼠心臟NOx的生物利用度降低VASP是cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶的下游靶物質(zhì)，磷酸化VASP(pVASP)的減少是反映NO/cGMP信號轉(zhuǎn)

6、導的一種敏感性指征。我們的研究表明，盡管成年大鼠和衰老大鼠心臟中總VASP水平相當，但是老年大鼠pVASP水平卻明顯降低(P<0.01，圖2)。 1．3老化心肌組織中硝基酪氨酸含量增加硝基化酪氨酸(NT)是表明ONOO<'->存在的“印跡”，本實驗用免疫組織化學方法檢測心肌組織中NT的含量來反映ONOO<'->的水平。結(jié)果顯示，成年大鼠心肌組織中未測得硝基酪氨酸，而老年大鼠心肌組織中則大量表達(P<0.01，圖3)。 2

7、．衰老心肌對缺血/再灌注損傷易感性增加。 2．1不同年齡正常組大鼠細胞凋亡、心功能指標的改變。 2．1．1年齡因素對正常大鼠心肌細胞凋亡的影響正常老年大鼠心肌細胞的凋亡指數(shù)為(2.50±0.22％)、Caspase-3活性為(306±29μmol pNA/mg)，均高于正常成年組(0.70±0.15％、152±22μmol pNA/mg)(P<0.05，表1，圖7—9)。 2.1.2年齡因素對正常大鼠心功能的影響

8、與正常成年組比較，正常老年組大鼠左室舒張壓(LVDP) 和左室舒張末壓(LVEDP)均顯著升高(P<0.01，圖10，11)；正常老年組大鼠CI(心室收縮指數(shù))(圖12)和左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dt<,max>)均明顯下降(P<0.01，圖12，13)。 2.2不同年齡心肌缺血/再灌注組大鼠細胞凋亡、心梗面積、心功能指標的改變。 2.2.1年齡因素對缺血/再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響與正常成年大鼠和正常老年大鼠

9、相比，心肌缺血/再灌注均引起成年大鼠和老年大鼠顯著的心肌細胞凋亡現(xiàn)象。老年大鼠缺血/再灌注區(qū)心肌細胞的凋亡指數(shù)為(19.0±2.1％)、Caspase-3活性為(436±35μmol pNA/mg)，均明顯高于成年組(14.6±1.7％、340±321μmol pNA/mg，P<0.05)(表1，圖7-9)。 2.2.2年齡因素對缺血/再灌注大鼠心梗面積的影響心肌缺血/再灌注后，老年大鼠心梗面積較成年大鼠明顯增大(P<0.05，

10、表2，圖14，圖15b)。 2.2.3年齡因素對缺血/再灌注大鼠心功能的影響與成年心肌缺血/再灌注組比較，老年心肌缺血/再灌注組大鼠LNDP升高(圖16)、LVEDP升高(圖17)、再灌注3h后左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dt<,max>)明顯下降(P<0.05，圖18)；同時，與成年心肌缺血/再灌注組比較，心肌缺血/再灌注時老年大鼠CI明顯下降(P<0.05，圖19)、再灌注3h后+dp/dt<,max>顯著下降(P<0.

11、01，圖20)。 3.iNOS增高與衰老大鼠心肌缺血/再灌注損傷易感性增加有關(guān)。 3.1老年組大鼠心肌ONOO<'->含量增高本實驗以心肌組織中NT的含量來反映ONOO<'->的水平，采用雙抗體夾心ELISA法定量檢測心肌組織硝基酪氨酸含量。結(jié)果表明，正常老年大鼠心肌組織NT含量較正常成年組升高(P<0.05)；老年缺血/再灌注組心肌組織NT含量較成年缺血/再灌注組增高明顯(P<0.05，圖21)。 3.2老年組

12、大鼠心肌iNOS表達增高與正常成年大鼠比較，正常老年大鼠iNOS表達升高(P<0.05)：與成年缺血/再灌注組比較，老年缺血/再灌注組iNOS表達顯著升高(P<0.01，圖22)。 3.3給予iNOS阻斷劑1400W使老年缺血/再灌注大鼠心肌NT含量下降為進一步證實iNOS表達的增加是否與老年心臟中NT的增加有關(guān)，我們用iNOS的特異性阻斷劑1400W阻斷iNOS后發(fā)現(xiàn)，缺血/再灌注后，老年大鼠心肌組織的NT明顯下降(P<0.0

13、5，表3，圖21)。 3.4給予iNOS阻斷劑1400W使老年缺血/再灌注大鼠心肌細胞凋亡減少、梗塞面積減小。 3.4.1給予1400W后老年缺血/再灌注大鼠心肌細胞凋亡減少用iNOS的特異性阻斷劑1400W阻斷iNOS后，老年缺血/再灌注+1400W組凋亡指數(shù)為(3.10±0.30％)、Caspase-3活性為(345±30 μmol pNA/mg)，均低于老年缺血/再灌注組(19.00±2.10％、436±35μmo

14、l pNA/mg)(P<0.05，表1，圖7-9)。 3.4.2給予1400W后老年缺血/再灌注大鼠梗塞面積減小用iNOS的特異性阻斷劑1400W阻斷iNOS后，老年心肌缺血/再灌注+1400W組大鼠心梗面積較老年心肌缺血/再灌注組明顯減小(P<0.05，表2，圖14，15)。 研究結(jié)論： ①衰老使心肌對缺血/再灌注損傷易感性增加； ②衰老使心肌細胞中的NO、ONOO<'->含量增高，尤以具有強細胞毒性的