枸櫞酸預(yù)處理在大鼠心肌缺血再灌注中減輕心肌損傷作用.pdf

1、實驗背景:
　　 1960年， Jennings首次提出了心肌缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion，I/R)的概念，即心肌缺血后再灌注時，不僅未使組織器官功能恢復(fù)，反而將缺血所致的器官功能代謝障礙和組織結(jié)構(gòu)破壞進一步加重的現(xiàn)象。隨著“缺血再灌注損傷”這個概念提出以來，缺血再灌注損傷的機制越來越受到關(guān)注。細胞內(nèi)鈣代謝紊亂、氧自由基的產(chǎn)生和中性粒細胞浸潤是造成心肌缺血再灌注損傷的三個主要途徑。1972年Shen和

2、Jennings[2]發(fā)現(xiàn)犬心臟冠狀動脈短暫閉塞后復(fù)灌可加速細胞內(nèi)鈣離子的積聚，并首次提出鈣超載學(xué)說，人們自此將Ca2+在缺血再灌注損傷中的作用當(dāng)作研究的熱點。鈣超載對于心肌缺血再灌注的損傷包括:線粒體功能障礙;激活Ca2+依賴性磷脂酶，促進磷脂酶分解;促進氧自由基形成;引起心律失常。枸櫞酸又名檸檬酸，枸椽酸根離子可與血中鈣離子生成難解離的可溶性絡(luò)合物枸椽酸鈣，此絡(luò)合物易溶于水但不易解離，降低血清鈣離子濃度。假設(shè)枸櫞酸可能通過影響細胞外

3、的鈣離子參與心肌I/R損傷，從而可能產(chǎn)生心肌保護作用。本實驗采用大鼠在體心肌缺血再灌注模型，觀察枸櫞酸對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，探討枸櫞酸預(yù)處理是否在大鼠心肌I/R中有減輕損傷的作用。
　　 實驗?zāi)康?
　　 1.研究枸櫞酸預(yù)處理在大鼠心肌缺血再灌注中減輕損傷的作用。
　　 2.為臨床研究及干預(yù)心肌缺血再灌注病理過程提供新的思路及靶點。
　　 實驗內(nèi)容和方法:
　　 采用體重為350-400

4、g的健康雄性SD大鼠，建立大鼠在體缺血再灌注模型實驗?zāi)Ｐ停ńY(jié)扎冠狀動脈30min，再灌注120min），本實驗從五個方面進行研究:
　　 1.枸櫞酸對大鼠在體I/R模型心律和血流動力學(xué)的研究:健康雄性大鼠隨機分為5組，每組動物10只，各組經(jīng)尾靜脈于再灌前10分鐘給藥，記錄分析再灌注后120min室性心律失常和血流動力學(xué)的變化。
　　 2.枸櫞酸對大鼠血清Ca2+影響的研究:觀察在體大鼠給予0.05 mol·L-1枸櫞酸后

5、給藥前和給藥后5min、10min、15min、30min的頸動脈血樣，觀察枸櫞酸對血清Ca2+的影響，以探討枸櫞酸作用的可能機制。
　　 3.枸櫞酸對大鼠心肌細胞損傷的研究:利用大鼠在體缺血再灌注模型，再灌注120min末，采用Evans藍與TTC染色的方法測量缺血區(qū)及梗死區(qū)面積;再灌120min末以左心室心肌組織蛋白Capase-3活性為檢測指標，檢測枸櫞酸預(yù)處理在大鼠心肌缺血再灌注損傷中Capase-3蛋白活性的變化。

6、r>　　 4.枸櫞酸對缺血再灌注大鼠體內(nèi)內(nèi)源性感覺神經(jīng)肽（SP、CGRP）表達的影響:再灌注120min末提取各實驗組左心室心肌組織蛋白，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)，對Sham組、I/R組以及枸櫞酸預(yù)處理組的左心室心肌組織中的SP、CGRP進行檢測。
　　 5.枸櫞酸對缺血再灌注大鼠超氧化物歧化酶(SOD)的半定量分析:再灌注120min末提取各實驗組

7、左心室心肌組織蛋白，采用蛋白免疫印跡(western-blot)方法分析各實驗組SOD的含量，探究枸櫞酸是否提高氧自由基清除酶的活性。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.枸櫞酸對在體大鼠心肌缺血再灌注引起心律失常及血流動力學(xué)的影響
　　 1.1 心律失常再灌注期:與Sham組比較，I/R組發(fā)生室性心律失常發(fā)生數(shù)目明顯增多(P＜0.01);與I/R組比較，給藥組再灌注120min室性心律失常發(fā)生有下降的趨勢，其中0.05

8、M組有顯著性降低(P＜0.01)。從時間分布看，枸櫞酸下調(diào)室性心律失常的作用高峰主要集中在再灌注早期（20min內(nèi)）。
　　 1.2 血流動力學(xué)與Sham組比較，IR組的收縮壓、舒張壓、平均壓在再灌注后前30min降低明顯(P＜0.05);和I/R組相比，枸櫞酸預(yù)處理組的收縮壓，舒張壓以及平均動脈壓均有下降趨勢;脈壓差略有升高;心率變化略小，但均無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 2.枸櫞酸對大鼠血清鈣的影響:
　　 用藥后5

9、min的血清鈣離子濃度與用藥前比較降低7.64％(P＜0.001);用藥后10min顯著下降了20.52％(P＜0.05);用藥后15 min下降18.70％，但無統(tǒng)計學(xué)意義;用藥后30min，血清鈣回升4％。提示枸櫞酸在用藥10min螯合血清鈣離子的能力達到高峰。
　　 3.枸櫞酸對大鼠心肌損傷的影響:
　　 3.1 與I/R組相比:枸櫞酸預(yù)處理組再灌注120min后缺血區(qū)心肌AAR/LV都有減少，其中0.05M組缺血

10、面積減少了34％(n=6，P=0.01);枸櫞酸預(yù)處理組再灌注后IS/AAR均顯著減少40％以上(n=6，P＜0.05);枸櫞酸預(yù)處理組再灌注后IS/LV都有減少，其中0.05M組顯著縮小68％(n=6，P＜0.01);
　　 3.2 與Sham組比較，IR組明顯活性增加(P＜0.01);與I/R組相比，Caspase-3活性在給藥組都有下降趨勢，其中0.05M組降低最明顯(P＜0.01);與0.05M組比較，給藥組內(nèi)都有統(tǒng)計學(xué)

11、差異（0.1M組P＜0.01，0.01M組P＜0.01），但無劑量依賴性。
　　 4.枸櫞酸對大鼠內(nèi)源性P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽的影響
　　 4.1 SP-ELISA結(jié)果:
　　 與I/R組相比，0.05M組在再灌注后心肌組織中SP遞質(zhì)表達顯著上調(diào)24％(P＜0.05)，而0.1M組SP的表達明顯下降41％(P＜0.01)。
　　 4.2 CGRP-ELISA結(jié)果:
　　 與Sham組相比較，IR

12、組CGRP表達增多(P＜0.05);與I/R組相比，給藥組再灌注后的CGRP表達量均下降，其中0.05M組降低34％(P＜0.05);組內(nèi)比較0.05M組下降最顯著(P＜0.05)，但未發(fā)現(xiàn)劑量依賴性。
　　 5.SOD-Western Blot結(jié)果:
　　 和Sham(0.85±0.08)組相比，IR組(0.78±0.04)的SOD活性降低;與I/R組相比，給藥組0.01M組(1.20±0.12)、0.05M(1.30

13、±0.12)、0.1M組(1.16±0.12)明顯增加了SOD的釋放量，提高了氧自由基的清除力，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 實驗結(jié)論:枸櫞酸預(yù)處理對缺血再灌注大鼠心肌具有保護作用，其降低大鼠心律失常的嚴重程度，限制梗塞范圍的作用，以0.05M劑量組的作用效果更佳;枸櫞酸通過下調(diào)Caspase-3蛋白表達，降低缺血再灌注后大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)發(fā)揮抗細胞凋亡作用;初步證明枸櫞酸預(yù)處理可減輕心肌缺血再灌注損傷，具有心肌保護作